304 дат баспас болоттон жасалган спираль түтүкчөлөрүнүн химиялык компоненти, SPACA6 эктодоменинин структурасында гаметанын синтези менен байланышкан протеиндердин сакталган суперфамилиясы бар.

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Ар бир слайдда үч макала көрсөтүлгөн слайдерлер.Слайддар аркылуу өтүү үчүн артка жана кийинки баскычтарды же ар бир слайд аркылуу жылуу үчүн аягындагы слайд контроллер баскычтарын колдонуңуз.

SPACA6 сүт эмүүчүлөрдүн жыныстык көбөйүү учурунда гамета биригүү үчүн маанилүү болуп саналат сперматозоиддердин бетинде белок болуп саналат.Бул негизги ролуна карабастан, SPACA6 өзгөчө милдети начар түшүнүлөт.Биз 2.2 Å токтому менен SPACA6 клеткадан тышкары доменинин кристаллдык түзүлүшүн тактап, төрт тилкелүү байламтадан жана квази ийкемдүү шилтемелер менен кошулган Ig сымал β-сэндвичтерден турган эки домендүү протеинди ачып беребиз.Бул структура IZUMO1ге окшош, башка гамета синтези менен байланышкан протеин, SPACA6 жана IZUMO1 бул жерде IST супер үй-бүлөсү деп аталган уруктандыруу менен байланышкан протеиндердин супер үй-бүлөсүнүн негиздөөчү мүчөлөрүн түзөт.IST супер үй-бүлөсү түзүмдүк жактан анын ийилген төрт спирал байламы жана дисульфид менен байланышкан CXXC жуп мотивдери менен аныкталат.Адам протеомасынын структурасына негизделген AlphaFold издөө бул суперүй-бүлөнүн кошумча белок мүчөлөрүн аныктады;өзгөчө, бул белоктордун көбү гамета синтезине катышат.SPACA6 түзүмү жана анын IST супер үй-бүлөсүнүн башка мүчөлөрү менен болгон мамилеси сүт эмүүчүлөрдүн гаметаларынын синтези жөнүндөгү билимибиздеги жетишпеген шилтемени камсыз кылат.
Ар бир адамдын жашоосу эки өзүнчө гаплоиддик гаметалар менен башталат: атасынын сперматозоиди жана эненин жумурткасы.Бул сперматозоид интенсивдүү тандоо процессинин жеңүүчүсү болуп саналат, анын жүрүшүндө миллиондогон сперматозоид аялдардын жыныс органдарынан өтүп, ар кандай тоскоолдуктарды жеңип1 жана сыйымдуулуктан өтүшөт, бул алардын кыймылдуулугун жана беттик компоненттердин процессин күчөтөт2,3,4.Сперматозоид менен ооцит бири-бирин тапса дагы процесс бүтө элек.Ооцит кумулус клеткаларынын катмары жана zona pellucida деп аталган гликопротеиддик тосмолор менен курчалган, ал аркылуу сперматозоид овоцитке кириши керек.Сперматозоиддер бул акыркы тоскоолдуктарды жеңүү үчүн беттик адгезия молекулаларынын жана мембрана менен байланышкан жана секрецияланган ферменттердин комбинациясын колдонушат5.Бул молекулалар жана ферменттер негизинен ички мембранада жана акросомалык матрицада сакталып, сперматозоиддердин сырткы кабыкчасы акросомалык реакция учурунда лизденгенде аныкталат6.Бул интенсивдүү жолдун акыркы кадамы сперматозоид менен жумуртка биригүү окуясы болуп саналат, анда эки клетка мембраналарын бириктирип, бир диплоиддик организмге айланат7.Бул процесс адамдын репродукциясында жаңычыл болсо да, зарыл болгон молекулалык өз ара аракеттенүү начар түшүнүлөт.
Гаметалардын уруктанышынан тышкары, эки липиддик кош катмардын биригүү химиясы кеңири изилденген.Жалпысынан мембрананын биригүү процесси энергетикалык жагымсыз процесс, ал протеин катализаторунан структуралык конформациянын өзгөрүшүн талап кылат, ал эки мембрананы бири-бирине жакындатып, алардын үзгүлтүксүздүгүн бузуп, синтезди пайда кылат8,9.Бул белок катализаторлору fusogens катары белгилүү жана сансыз синтез системаларында табылган.Алар кабыл алуучу клеткаларга вирустун кириши үчүн зарыл (мисалы, HIV-1де gp160, коронавирустарда спике, грипп вирустарында гемагглютинин)10,11,12 плаценталык (синцитин)13,14,15 жана төмөнкү эукариоттордо гамета түзүүчү синтез ( HAP2/GCS1 өсүмдүктөрдө, протисттерде жана муунак буттууларда) 16,17,18,19.Адамдын гаметалары үчүн фузогендер али ачыла элек, бирок бир нече белоктор гаметалардын биригүү жана биригүү үчүн маанилүү экени далилденген.Ооцит-экспрессияланган CD9, чычкан менен адамдын жыныс клеткаларынын биригиши үчүн зарыл болгон трансмембраналык протеин биринчи болуп ачылган 21,22,23.Анын так функциясы бүдөмүк бойдон калууда, адгезиядагы ролу, жумуртка микровиллдериндеги адгезия очокторунун түзүлүшү жана/же ооцит бетинин белокторунун туура локализациясы 24,25,26 окшойт.Гаметанын синтези үчүн өтө маанилүү болгон эки эң типтүү протеин - бул IZUMO127 сперматозоид жана JUNO28 ооцит протеин жана алардын бири-бири менен байланышы гаметаларды таанууда жана биригүү алдында маанилүү кадам болуп саналат.Эркек Izumo1 нокаут чычкандары жана ургаачы Juno нокаут чычкандары толугу менен стерилдүү, бул моделдерде сперматозоид перивителлиндик мейкиндикке кирет, бирок гаметалар биригип кетпейт.Ошо сыяктуу эле, адамдын экстракорпоралдык уруктандыруу эксперименттеринде гаметалар анти-IZUMO1 же JUNO27,29 антителолору менен дарыланганда кошулуу азайган.
Жакында IZUMO1 жана JUNO20,30,31,32,33,34,35 фенотипине окшош сперматозоиддердин жаңы ачылган тобу табылды.Сперма акросомалык мембрана менен байланышкан протеин 6 (SPACA6) ири масштабдуу мышыктардын мутагенезин изилдөөдө уруктануу үчүн маанилүү экендиги аныкталган.Spaca6 генине трансгенди киргизүү эрибей турган сперматозоиддерди пайда кылат, бирок бул сперматозоиддер перивителлиндик мейкиндикке 36 кирип кетет.чычкандардын кийинки нокаут изилдөөлөр Spaca6 гамета биригүү 30,32 үчүн зарыл экенин тастыктады.SPACA6 дээрлик жалаң урук бездеринде чагылдырылат жана IZUMO1ге окшош локализациялык схемага ээ, тактап айтканда, акросомалык реакцияга чейин сперматозоиддердин интимасынын ичинде, андан кийин акросомалык реакциядан кийин экватордук аймакка көчүп кетет 30,32.Spaca6 гомологдору сүт эмүүчүлөрдүн жана башка эукариоттордун 30 ар түрдүү бар жана адамдын гамета биригүү үчүн анын мааниси SPACA6 30 каршылык менен in vitro адамдын уруктандыруу бөгөт коюу менен көрсөтүлгөн.IZUMO1 жана JUNOдан айырмаланып, SPACA6 түзүлүшү, өз ара аракеттенүүсү жана функциясынын чоо-жайы белгисиз бойдон калууда.
Адамдын сперматозоиддери менен жумурткаларынын биригүүсүнүн негизинде жаткан негизги процессти жакшыраак түшүнүү үчүн, үй-бүлөнү пландаштыруу жана төрөттү дарылоо боюнча келечектеги өнүгүүлөр жөнүндө маалымат берүүгө мүмкүндүк берет, биз SPACA6 структуралык жана биохимиялык изилдөөлөрдү жүргүздүк.SPACA6 клеткадан тышкаркы доменинин кристаллдык түзүлүшү квази ийкемдүү аймактар ​​менен байланышкан төрт спиралдык байлам (4HB) жана иммуноглобулин сымал (Ig сыяктуу) доменди көрсөтөт.Мурунку изилдөөлөрдө болжолдонгондой, 7,32,37 SPACA6 доменинин структурасы адамдын IZUMO1 түзүмүнө окшош жана эки протеин адаттан тыш мотивди бөлүшөт: үч бурчтуу спираль бети менен 4HB жана жуп дисульфид менен байланышкан CXXC мотивдери.Биз IZUMO1 жана SPACA6 азыр гамета биригүү менен байланышкан протеиндердин чоң, структуралык жактан байланышкан супер үй-бүлөсүн аныктоону сунуштайбыз.Супер үй-бүлөгө уникалдуу функцияларды колдонуп, биз AlphaFold структуралык адам протеомуна толук издөө жүргүздүк, бул суперүйбүлөнүн кошумча мүчөлөрүн, анын ичинде гаметалардын синтезине жана/же уруктандырууга катышкан бир нече мүчөлөрдү аныктадык.Азыр гаметалардын синтези менен байланышкан протеиндердин жалпы структуралык бүктөлүшү жана суперфамилиясы бар экени көрүнүп турат жана биздин структура адам гаметасынын биригүү механизминин бул маанилүү аспектинин молекулярдык картасын берет.
SPACA6 бир N-байланышкан гликан жана алты болжолдуу дисульфиддик байланыштары бар бир өтүүчү трансмембраналык протеин (Figure S1a жана S2).Биз Drosophila S2 клеткаларында адамдын SPACA6 (калдыктары 27-246) клеткадан тышкаркы домен билдирди жана никель жакындык, катион алмашуу жана өлчөмү четтетүү хроматография (сүрөт. S1b) колдонуп белок тазаланган.Тазаланган SPACA6 эктодомени абдан туруктуу жана бир тектүү.Көп бурчтуу жарык чачыратуу (SEC-MALS) менен айкалышкан өлчөмдү алып салуу хроматографиясын колдонуу менен талдоо 26,2 ± 0,5 кДа эсептелген молекулярдык салмагы менен бир чокусун көрсөттү (сүрөт S1c).Бул SPACA6 мономердик эктодомендин өлчөмүнө шайкеш келет, бул тазалоо учурунда олигомеризация болбогонун көрсөтүп турат.Мындан тышкары, тегерек дихроизм (CD) спектроскопиясы эрүү температурасы 51,3 °C болгон α/β аралаш структурасын аныктады (S1d,e-сүрөт).CD спектрлеринин деконволюциясы 38,6% α-спиральдуу жана 15,8% β-тилчелүү элементтерди аныктады (S1d сүрөт).
SPACA6 эктодомени туш келди матрицаны себүү38 аркылуу кристаллдаштырылган, натыйжада 2,2 Å резолюцияга ээ болгон маалыматтар топтому (таблица 1 жана S3 сүрөт).Структураны аныктоо үчүн фрагментке негизделген молекулярдык алмаштыруунун жана SAD фазалык маалыматтарынын бромид таасири менен айкалышын колдонуу (таблица 1 жана S4 сүрөт), акыркы такталган модель 27–246 калдыктарынан турат.Түзүм аныкталган учурда, эч кандай эксперименталдык же AlphaFold структуралары болгон эмес.SPACA6 эктодоменинин өлчөмү 20 Å × 20 Å × 85 Å, жети спиралдан жана тогуз β-тилден турат жана алты дисульфиддик байланыш менен турукташкан узартылган үчүнчү бүктөлүшү бар (сүрөт 1а, б).Asn243 каптал чынжырынын аягындагы алсыз электрон тыгыздыгы бул калдыктын N-байланышкан гликозилдөө экенин көрсөтүп турат.Структура эки доменден турат: N-терминалдык төрт спиралдуу байламта (4HB) жана алардын ортосунда аралык шарнир аймагы бар C-терминал Ig сымал домен (сүрөт 1c).
SPACA6 клеткадан тышкаркы доменинин структурасы.SPACA6 клеткадан тышкаркы доменинин тилке диаграммасы, чынжырдын Nдан C-терминусуна чейин кочкул көктөн кочкул кызылга чейин.Дисульфиддик байланыштарга катышкан цистеиндер кызгылт түстө белгиленген.b SPACA6 клеткадан тышкаркы доменинин топологиясы.Сүрөт 1адагыдай эле түс схемасын колдонуңуз.c SPACA6 клеткадан тышкаркы домен.4HB, шарнир жана Ig сыяктуу домен тилке диаграммалары тиешелүүлүгүнө жараша кызгылт сары, жашыл жана көк түстө.Катмарлар масштабга тартылбайт.
SPACA6 нын 4HB доменине төрт негизги спирал кирет (спиральдар 1–4), алар спиралдуу спираль түрүндө жайгашат (сүрөт 2а), параллелге каршы жана параллелдүү өз ара аракеттешүү (сүрөт 2б).Кичинекей кошумча бир айлануу спиралы (спирал 1′) байламга перпендикуляр коюлуп, 1 жана 2 спиралдары бар үч бурчтук түзүлөт. Бул үч бурчтук 3 жана 4-спиральдардын салыштырмалуу тыгыз таңгагынын спираль-бурулган таңгагында бир аз деформацияланган. 2а).
4HB N-терминал тилке диаграммасы.b Төрт спиралдан турган байламдын үстүнкү көрүнүшү, ар бир спирал N-терминуста кочкул көк түс менен жана C-терминуста кочкул кызыл менен белгиленген.c 4HB үчүн жогорудан ылдыйга спиралдык дөңгөлөк диаграммасы, ар бир калдык бир тамгадан турган аминокислота коду менен белгиленген тегерек катары көрсөтүлгөн;дөңгөлөктүн үстүндөгү төрт аминокислота гана номерленген.Полярдуу эмес калдыктар сары түстө, полярдык зарядсыз калдыктар жашыл түстө, оң заряддуу калдыктар көк түстө, терс заряддуу калдыктар кызыл түстө.d 4HB доменинин үч бурчтуу беттери, 4HBs кызгылт сары жана илмектери жашыл түстө.Экөө тең таякча сымал дисульфиддик байланыштарды көрсөтөт.
4HB негизинен алифаттык жана ароматтык калдыктардан турган ички гидрофобдук өзөктө топтолгон (сүрөт 2c).Өзөктө Cys41 жана Cys55 ортосундагы дисульфиддик байланыш бар, ал 1 жана 2 спиральдарды үстүнкү көтөрүлгөн үч бурчтукта бириктирет (сүрөт 2d).Эки кошумча дисульфиддик байланыштар Helix 1'деги CXXC оюму менен шарнир аймагындагы β-чачтын учунда табылган башка CXXC мотивинин ортосунда түзүлдү (сүрөт 2d).Белгисиз функциясы бар консервативдүү аргинин калдыктары (Arg37) 1′, 1 жана 2 спиралдарынан түзүлгөн көңдөй үч бурчтуктун ичинде жайгашкан. Cβ, Cγ жана Cδ Arg37 алифаттык көмүртек атомдору гидрофобдук өзөк менен өз ара аракеттенишет жана анын гуанидин топтору циклдик кыймылдашат. Thr32 омурткасы менен каптал чынжырынын ортосундагы өз ара аракеттенүү аркылуу 1′ жана 1 спиральдарынын ортосунда (сүрөт S5a, b).Tyr34 Arg37 эриткич менен өз ара аракеттене турган эки кичинекей көңдөйлөрдү калтырып, көңдөйгө жайылып кетет.
Ig сымал β-сэндвич домендери - гидрофобдук өзөк аркылуу өз ара аракеттенген эки же андан көп көп тилкелүү амфипатикалык β-баракчалардын жалпы өзгөчөлүгүн бөлүшкөн протеиндердин чоң суперфамилясы. жана эки катмардан турат (S6a-сүрөт).1-баракча төрт жиптен (D, F, H жана I) турган β-баракча болуп саналат, мында F, H жана I жипчелери антипараллель түзүлүштү түзүшөт, ал эми I жана D жипчелери параллелдүү өз ара аракеттенишүүдө.2-таблица кичинекей анти-параллель кош саптуу бета барагы (E жана G жиптери).Е чынжырынын С-терминусу менен Н чынжырынын (Cys170-Cys226) ортосунда ички дисульфиддик байланыш байкалды (S6b-сүрөт).Бул дисульфиддик байланыш иммуноглобулиндин β-сэндвич домениндеги дисульфиддик байланышка окшош.40,41.
Төрт жиптүү β-баракчасы бүт узундугу боюнча бурулуп, формасы жана электростатикасы боюнча айырмаланган асимметриялык кырларды түзөт.Ичке чети SPACA6дагы калган тегиз эмес жана электростатикалык ар түрдүү беттерге салыштырмалуу өзгөчөлөнүп турган жалпак гидрофобдук экологиялык бет (сүрөт S6b,c).Омуртканын карбонил/амин топторунун жана полярдык каптал чынжырларынын галосу гидрофобдук бетти курчап турат (S6c-сүрөт).Кеңирээк чети гидрофобдук өзөктүн N-терминалдык бөлүгүн тоскон жана F чынжырынын магистралынын ачык полярдык тобу менен үч суутек байланышын түзүүчү капкакталган спираль сегмент менен капталган (сүр. S6d).Бул четинин C-терминалдык бөлүгү жарым-жартылай ачык гидрофобдук өзөгү бар чоң чөнтөктү түзөт.Чөнтөк кош аргинин калдыктарынын үч топтому (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 жана Arg212-Arg214) жана борбордук гистидиндин (His220) эсебинен оң заряддар менен курчалган (сүрөт S6e).
Шарнир аймагы - бул спиралдуу домен менен Ig сымал домендин ортосундагы кыска сегмент, ал бир антипараллель үч тилкелүү β-катмардан (A, B жана C тилкелери), кичинекей 310 спиралдан жана бир нече узун кокустук спираль сегменттерден турат.(S7-сүрөт).Шарнир аймагындагы коваленттик жана электростатикалык байланыштар тармагы 4HB менен Ig сымал домендин ортосундагы багытты турукташтырат.Тармакты үч бөлүккө бөлүүгө болот.Биринчи бөлүктө эки CXXC мотиви (27CXXC30 жана 139CXXC142) камтылган, алар шарнирдеги β-чач кыпчуур менен 4HBдеги 1′ спиралынын ортосунда жуп дисульфиддик байланышты түзүшөт.Экинчи бөлүк Ig сыяктуу домен менен шарнирдин ортосундагы электростатикалык өз ара аракеттенүүнү камтыйт.Шарнирдеги Glu132 Ig сымал домендеги Arg233 жана шарнирдеги Arg135 менен туз көпүрөсүн түзөт.Үчүнчү бөлүгү Ig сымал домен менен шарнир аймагынын ортосундагы коваленттик байланышты камтыйт.Эки дисульфиддик байланыш (Cys124-Cys147 жана Cys128-Cys153) шарнир циклин Gln131 менен магистралдык функционалдык топтун ортосундагы электростатикалык өз ара аракеттешүү аркылуу турукташкан байланыштыргычка туташтыруу менен биринчи Ig сымал доменге кирүүгө мүмкүндүк берет.чынжыр.
SPACA6 ectodomain түзүмү жана 4HB жана Ig сыяктуу домендердин жеке структуралары белок маалымат базалары 42 структуралык окшош жазууларды издөө үчүн колдонулган.Биз дал келүүлөрдү Dali Z жогорку упайлары, кичинекей стандарттык четтөөлөр жана чоң LALI упайлары менен аныктадык (акыркысы структуралык жактан эквиваленттүү калдыктардын саны).Толук эктодоменди издөөнүн алгачкы 10 хитинин (таблица S1) алгылыктуу Z упайы >842 болсо, 4HB же Ig сыяктуу доменди издөө бул хиттердин көбү β-сэндвичтерге гана туура келгенин көрсөттү.көп белоктордо кездешүүчү бүктөм.Далидеги үч издөө тең бир гана натыйжа берди: IZUMO1.
SPACA6 жана IZUMO1 түзүмдүк окшоштуктарды бөлүшөт деп көптөн бери айтылып келет7,32,37.Бул эки гамета синтези менен байланышкан протеиндердин эктодомендери 21% гана ырааттуулукту бөлүштүрсө да (S8a сүрөтү), комплекстүү далилдер, анын ичинде сакталган дисульфиддик байланыш үлгүсү жана SPACA6да болжолдонгон C-терминал Ig сыяктуу домен, IZUMO1ди шаблон катары колдонгон SPACA6 чычканынын гомологиялык модели37.Биздин түзүм бул божомолдорду ырастап, окшоштуктун чыныгы деңгээлин көрсөтөт.Чынында, SPACA6 жана IZUMO137,43,44 түзүмдөрү шарнир аймагы менен байланышкан окшош 4HB жана Ig сымал β-сэндвич домендери менен бирдей эки домендүү архитектураны (сүрөт S8b) бөлүшөт (сүрөт S8c).
IZUMO1 жана SPACA6 4HB кадимки спиралдык таңгактардан жалпы айырмачылыктарга ээ.Типтүү 4HBs, эндосомдук биригүү 45,46 катышкан SNARE протеин комплекстеринде табылган сыяктуу, борбордук огтун айланасында туруктуу ийриликти сактаган бирдей аралыкта спиральдар бар 47. Ал эми IZUMO1 жана SPACA6 экөө тең спираль домендери бурмаланган, өзгөрүлмө ийрилик менен жана тегиз эмес таңгактоо (сүрөт S8d).1′, 1 жана 2 бурчтуктар түзгөн үч бурчтуктан улам пайда болгон бурма IZUMO1 жана SPACA6да сакталып, 1′ спиралында ошол эле CXXC мотиви менен турукташтырылган.Бирок, SPACA6да табылган кошумча дисульфиддик байланыш (жогоруда 1 жана 2 спиральдарды коваленттүү байланыштырган Cys41 жана Cys55) үч бурчтуктун чокусунда курчураак чокусун жаратып, SPACA6ны IZUMO1ге караганда бурчтуураак кылып, көңдөй үч бурчтуктары айкыныраак кылат.Мындан тышкары, IZUMO1де SPACA6да бул көңдөйдүн борборунда байкалган Arg37 жок.Ал эми IZUMO1 алифаттык жана жыпар жыттуу калдыктардын бир кыйла типтүү гидрофобдук өзөгүнө ээ.
IZUMO1 эки жана беш тилкелүү β-баракчадан турган Ig сымал доменге ээ.IZUMO1деги кошумча жип SPACA6дагы катушканы алмаштырат, ал жиптеги магистралдык суутек байланыштарын чектөө үчүн F тилкеси менен өз ара аракеттенет.Салыштыруунун кызыктуу жери бул эки белоктун Ig сымал домендеринин болжолдуу беттик заряды.IZUMO1 бети SPACA6 бетине караганда терс заряддуураак.Кошумча заряд сперматозоиддердин кабыкчасына караган С-терминусуна жакын жайгашкан.SPACA6да ошол эле аймактар ​​көбүрөөк нейтралдуу же оң заряддуу болгон (сүрөт S8e).Мисалы, SPACA6дагы гидрофобдук бет (жука четтери) жана оң заряддуу чуңкурлар (кеңирээк четтери) IZUMO1де терс заряддуу.
IZUMO1 жана SPACA6 ортосундагы мамилелер жана экинчи структура элементтери жакшы сакталган болсо да, Ig сыяктуу домендердин структуралык тегиздөө эки домендердин бири-бирине карата жалпы багыты боюнча айырмаланарын көрсөттү (сүрөт. S9).IZUMO1дин спиралдык таңгагы β-сэндвичтин тегерегинде ийри болуп, борбордук огунан болжол менен 50° бурчта мурда сүрөттөлгөн “бумеранг” формасын түзөт.Ал эми, SPACA6дагы спираль нуру карама-каршы багытта болжол менен 10° кыйшайган.Бул багыттардагы айырмачылыктар шарнир чөлкөмүндөгү айырмачылыктарга байланыштуу болушу мүмкүн.Негизги ырааттуулук деңгээлинде IZUMO1 жана SPACA6 цистеин, глицин жана аспарагин кислотасынын калдыктарын кошпогондо, шарнирдеги ырааттуулуктун окшоштугун бөлүшөт.Натыйжада, суутек байланыштары жана электростатикалык тармактар ​​такыр башкача.β-баракчанын экинчилик структурасынын элементтери IZUMO1 жана SPACA6 тарабынан бөлүшүлгөн, бирок IZUMO1деги чынжырлар бир топ узун жана 310 спираль (спирал 5) SPACA6 үчүн уникалдуу.Бул айырмачылыктар эки башка окшош белок үчүн ар кандай домен багыттарын алып келет.
Биздин Дали сервериндеги издөөбүз SPACA6 жана IZUMO1 бул өзгөчө 4HB бүктөлүшүнө ээ болгон протеиндер базасында сакталган эксперименталдык түрдө аныкталган эки гана структура экенин көрсөттү (таблица S1).Жакында DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold, нейрондук тармакка негизделген системаны иштеп чыкты, ал протеиндердин 3D түзүмдөрүн баштапкы ырааттуулуктардан так болжолдой алат48.SPACA6 түзүмүн чечкенибизден көп өтпөй, AlphaFold маалымат базасы чыгарылып, адам протеомундагы бардык белоктордун 98,5% камтыган болжолдуу структура моделдерин камсыз кылды48,49.Биздин чечилген SPACA6 түзүмүн издөө модели катары колдонуп, AlphaFold адам протеомундагы моделди структуралык гомологиялык издөө SPACA6 жана IZUMO1ге структуралык окшоштуктары бар талапкерлерди аныктады.SPACA6 (сүр. S10a) - өзгөчө 1,1 Å rms эктодоменин биздин чечилген структурага салыштырганда (S10b-сүрөт) - AlphaFoldтун укмуштуудай тактыгын эске алып, SPACA6 дал келүүлөрү так болушу мүмкүн деп ишенсек болот.
Буга чейин PSI-BLAST IZUMO1 кластерин сперма менен байланышкан башка үч белоктор менен издеген: IZUMO2, IZUMO3 жана IZUMO450.AlphaFold бул IZUMO үй-бүлө протеиндери IZUMO1 сыяктуу дисульфиддик байланыш үлгүсү менен 4HB доменине бүктөлөөрүн алдын ала айткан (сүрөт 3a жана S11), бирок аларда Ig сыяктуу домен жок.IZUMO2 жана IZUMO3 IZUMO1ге окшош бир жактуу мембраналык протеиндер деп болжолдонууда, ал эми IZUMO4 бөлүнүп чыгат.Гаметанын синтезиндеги IZUMO 2, 3 жана 4 белокторунун функциялары аныкталган эмес.IZUMO3 сперматозоиддердин өнүгүшүндө51 акросома биогенезинде роль ойной турганы белгилүү жана IZUMO протеини комплексти50 түзөөрү аныкталган.Сүт эмүүчүлөрдүн, сойлоп жүрүүчүлөрдүн жана жерде-сууда жашоочулардын IZUMO протеиндеринин сакталышы алардын потенциалдуу функциясы DCST1/2, SOF1 жана FIMP сыяктуу гаметалык синтез менен байланышкан башка белоктордун функцияларына дал келерин көрсөтүп турат.
IST супер үй-бүлөсүнүн домен архитектурасынын диаграммасы, тиешелүүлүгүнө жараша кызгылт сары, жашыл жана көк түстөр менен белгиленген 4HB, шарнир жана Ig сыяктуу домендери.IZUMO4 кара көрүнгөн уникалдуу C-терминал аймагына ээ.Ырасталган жана болжолдуу дисульфиддик байланыштар тиешелүүлүгүнө жараша катуу жана чекиттүү сызыктар менен көрсөтүлгөн.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1Zold (TMEMF1Zold) жана DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) панели А сыяктуу түс диапазонунда көрсөтүлөт. Дисульфиддик байланыштар кызгылт түстө көрсөтүлгөн.TMEM95, IZUMO2 жана IZUMO3 трансмембраналык спиралдары көрсөтүлгөн эмес.
IZUMO протеининен айырмаланып, башка SPACA белоктору (б.а., SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 жана SPACA9) SPACA6дан структуралык жактан айырмаланат (сүрөт S12).SPACA9 гана 4HB бар, бирок ал SPACA6 сыяктуу эле параллель-анти-параллель багыты же бирдей дисульфиддик байланыш болушу күтүлбөйт.SPACA1 гана Ig окшош доменге ээ.AlphaFold SPACA3, SPACA4 жана SPACA5 SPACA6га караганда такыр башка түзүлүшкө ээ деп болжолдойт.Кызыктуусу, SPACA4 уруктанууда роль ойной турганы белгилүү, бирок SPACA6га караганда көбүрөөк деңгээлде, анын ордуна сперматозоид менен ооцит zona pellucida52 ортосундагы өз ара аракеттенүүнү жеңилдетет.
Биздин AlphaFold издөөбүз IZUMO1 жана SPACA6 4HB, TMEM95 үчүн башка дал келүүнү тапты.TMEM95, бир сперматозоиддерге мүнөздүү трансмембраналык протеин, 32,33 аблацияланганда эркек чычкандарды тукумсуз кылат.TMEM95 жок сперматозоиддер нормалдуу морфологияга, кыймылдуулукка жана zona pellucidaга кирип, жумуртка кабыкчасына байланышууга жөндөмдүү болгон, бирок ооцит мембранасы менен биригип кете алган эмес.Мурунку изилдөөлөр көрсөткөндөй, TMEM95 IZUMO133 менен структуралык окшоштуктарды бөлүшөт.Чынында эле, AlphaFold модели TMEM95 IZUMO1 жана SPACA6 сыяктуу эле жуп CXXC мотивдери менен 4HB экенин жана SPACA6да табылган 1 жана 2 спиральдардын ортосундагы ошол эле кошумча дисульфиддик байланыш экенин тастыктады (сүрөт 3a жана S11).TMEM95те Ig сымал домен жок болсо да, ал SPACA6 жана IZUMO1 шарнир аймактарына окшош дисульфиддик байланыш үлгүсү бар аймакка ээ (сүрөт 3б).Бул кол жазманы басып чыгаруу учурунда алдын ала басып чыгаруу сервери AlphaFold53 натыйжасын тастыктаган TMEM95 түзүмүн билдирди.TMEM95 SPACA6 жана IZUMO1ге абдан окшош жана эволюциялык жол менен амфибияларда сакталып калган (сүрөт 4 жана S13).
PSI-BLAST издөөсүндө бул тизмектердин жашоо дарагындагы ордун аныктоо үчүн NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP жана SOF1 маалымат базалары колдонулган.Тармактык чекиттердин ортосундагы аралыктар масштабда көрсөтүлгөн эмес.
SPACA6 жана IZUMO1 ортосундагы укмуштуудай жалпы структуралык окшоштук алар TMEM95 жана IZUMO 2, 3 жана 4 белокторун камтыган консервацияланган структуралык суперүй-бүлөнүн негиздөөчү мүчөлөрү экенин көрсөтүп турат.белгилүү мүчөлөр: IZUMO1, SPACA6 жана TMEM95.Бир нече гана мүчөлөр Ig сымал домендерге ээ болгондуктан, IST супер үй-бүлөсүнүн өзгөчөлүгү 4HB домени болуп саналат, ал бардык протеиндерге мүнөздүү уникалдуу өзгөчөлүктөргө ээ: 1) Параллель/параллелге каршы кезектешип жайгашкан бурмаланган 4HB (сүрөт 1) . 5a), 2) байламдын боо ичиндеги эки спиралдан жана үчүнчү вертикалдуу спиралдан турган үч бурчтуу бети бар (сүрөт. Негизги аймак (сүр. 5c). Тиоредоксин сымал белоктордо табылган CXXC мотивинин иштеши белгилүү. редокс сенсору катары 54,55,56, ал эми IST үй-бүлө мүчөлөрүнүн мотиви гаметалардын синтезиндеги ERp57 сыяктуу протеин дисульфид изомеразалары менен байланыштырылышы мүмкүн.Ролдор 57,58 менен байланышкан.
IST суперфамилиясынын мүчөлөрү 4HB доменинин үч мүнөздүү белгилери менен аныкталат: параллелдүү жана антипараллельдик ориентациянын ортосунда алмашып турган төрт спирал, ба-үч бурчтуу спираль боо беттери жана майда молекулалардын ортосунда пайда болгон ca CXXC кош мотиви.) N-терминалдык спиралдары (кызгылт сары) жана шарнир чөлкөмү β-чач (жашыл).
SPACA6 менен IZUMO1дин окшоштугун эске алуу менен, биринчисинин IZUMO1 же JUNO менен байланышуу жөндөмдүүлүгү сыналган.Biolayer interferometry (BLI) мурда IZUMO1 жана JUNO ортосундагы өз ара санын аныктоо үчүн колдонулган кинетикалык негизделген байланыш ыкмасы болуп саналат.Биотин менен белгиленген сенсор IZUMO1 менен JUNO аналитинин жогорку концентрациясы бар жем катары инкубациялангандан кийин күчтүү сигнал аныкталды (сүр. S14a), бул сенсордун учуна тиркелген биоматериалдын калыңдыгынын милдеттүү түрдө өзгөрүшүн көрсөтүүчү.Окшош сигналдар (б.а., сенсорго IZUMO1 аналитине каршы жем катары JUNO кошулган) (сүр. S14b).SPACA6 сенсор менен байланышкан IZUMO1 же сенсор менен байланышкан JUNOга каршы аналит катары колдонулганда эч кандай сигнал табылган жок (Figure S14a,b).Бул сигналдын жоктугу SPACA6 клеткадан тышкаркы домен IZUMO1 же JUNO клеткадан тышкаркы домен менен өз ара эмес экенин көрсөтүп турат.
BLI талдоо жем протеин боюнча эркин лизин калдыктарын biotinylation негизделген, анткени, бул өзгөртүү лизин калдыктары өз ара катышкан болсо, милдеттүү түрдө алдын алат.Мындан тышкары, сенсорго карата байланыштыруу багыты стерикалык тоскоолдуктарды жаратышы мүмкүн, ошондуктан кадимки суурулуп чыгуучу анализдер рекомбинантты SPACA6, IZUMO1 жана JUNO эктодомендеринде да аткарылган.Буга карабастан, SPACA6 анын тегине коюлган IZUMO1 же анын белгиси коюлган JUNO (сүр. S14c,d) менен чөккөн жок, бул BLI эксперименттеринде байкалган эч кандай өз ара аракеттенүүнү көрсөтүп турат.Оң көзөмөл катары, биз JUNO менен анын IZUMO1 деп белгиленген өз ара аракеттенүүсүн тастыктадык (Figure S14e жана S15).
SPACA6 менен IZUMO1дин ортосундагы структуралык окшоштукка карабастан, SPACA6нын JUNOну байланыштыра албаганы таң калыштуу эмес.Адамдын IZUMO1 бетинде JUNO менен өз ара аракеттенген 20дан ашык калдыктар бар, анын ичинде үч аймактын ар биринин калдыктары (алардын көбү шарнир аймагында жайгашкан) (сүрөт S14f).Бул калдыктардын ичинен бирөө гана SPACA6да (Glu70) сакталган.Көптөгөн калдык алмаштыруулар баштапкы биохимиялык касиеттерин сактап калса да, IZUMO1деги маанилүү Arg160 калдыктары SPACA6дагы терс заряддуу Asp148 менен алмаштырылган;мурунку изилдөөлөр көрсөткөндөй, IZUMO1деги Arg160Glu мутация дээрлик толугу менен JUNO43 менен байланышты жокко чыгарат.Мындан тышкары, IZUMO1 жана SPACA6 ортосундагы домен багытындагы айырма SPACA6 боюнча эквиваленттүү аймактын JUNO-байланыштуу сайтынын бетинин аянтын бир топ жогорулатты (S14g-сүрөт).
Гаметанын синтези үчүн SPACA6га белгилүү болгон муктаждыкка жана анын IZUMO1ге окшоштугуна карабастан, SPACA6 эквиваленттүү JUNO милдеттүү функциясына ээ эмес.Ошондуктан, биз структуралык маалыматтарыбызды эволюциялык биология тарабынан берилген маанилүү далилдер менен бириктирүүгө аракет кылдык.SPACA6 гомологдорунун ырааттуулугу сүт эмүүчүлөрдөн тышкары жалпы структуранын сакталышын көрсөтөт.Мисалы, цистеиндин калдыктары алыскы тектеш амфибияларда да бар (сүр. 6а).ConSurf серверин колдонуу менен, 66 ырааттуулуктун бир нече ырааттуулугун түздөө сактоо маалыматтары SPACA6 бетине түшүрүлгөн.Анализдин бул түрү белоктун эволюциясында кайсы калдыктар сакталганын көрсөтө алат жана кайсы беттик аймактар ​​функцияда роль ойноорун көрсөтө алат.
a CLUSTAL OMEGA аркылуу даярдалган 12 түрдүү түрдөгү SPACA6 эктодомендерин ырааттуу тегиздөө.ConSurf анализине ылайык, эң эскичил позициялар көк түс менен белгиленген.Цистеин калдыктары кызыл менен белгиленген.Домендин чек аралары жана экинчи структуранын элементтери тегиздөөнүн жогору жагында көрсөтүлгөн, мында жебелер β-тилдерди, ал эми толкундар спиральдарды көрсөтөт.Ырааттуулуктарды камтыган NCBI мүмкүндүк идентификаторлору: адам (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), капучин маймыл (Cebus mimic, XP_017359366), killball жылкысы (Equcin3, XP_012) us orca3_23 XP_032_034) .), кой (Ovis aries, XP_014955560), пил (Loxodonta africana, XP_010585293), ит (Canis lupus familyis, XP_025277208), чычкан (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian_01, XP36, XP36 318), Platypus, 8) , 61_89 жана Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Номерлөө адамдын тартибине негизделген.b SPACA6 түзүмүнүн үстүнкү сүрөттөлүшү үстү жагында 4HB жана ылдыйда Ig сыяктуу домен, түстөр ConSurf серверинен сакталган баалардын негизинде.Эң жакшы сакталган бөлүктөрү көк түстө, орточо сакталган бөлүктөрү ак түстө, эң аз сакталганы сары түстө.кызгылт көк цистеин.Коргоонун жогорку деңгээлин көрсөткөн үч беттик тактар ​​1, 2 жана 3-патчтар менен белгиленген. 4HB мультфильми үстүнкү оң жактагы инстанцияда көрсөтүлгөн (ошол эле түс схемасы).
SPACA6 структурасында үч жогорку деңгээлде сакталган беттик аймак бар (сүрөт 6б).1-патч 4HB жана шарнир аймагын камтыйт жана эки сакталган CXXC дисульфиддик көпүрөсүн, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 шарнир тармагын (сүр. S7) жана үч сакталган сырткы жыпар жыттуу калдыктарды (Phe31, Tyr73, Phe13) камтыйт.сперматозоиддердин бетиндеги бир нече оң заряддуу калдыктарды чагылдырган Ig сымал домендин кенен чети (S6e-сүрөт).Кызыгы, бул патчта SPACA6 30 функциясына тоскоол боло турган антитело эпитопу бар.3-аймак Ig сымал домендин шарнигин жана бир тарабын камтыйт;бул аймак сакталган пролиндерди (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) жана сыртка караган полярдуу/заряддалган калдыктарды камтыйт.Таң калыштуусу, 4HB бетиндеги калдыктардын көпчүлүгү өтө өзгөрүлмөлүү (сүрөт. 6b), бирок бүктөм SPACA6 гомологунун боюнда (гидрофобдук байламчанын консерватизми көрсөткөндөй) жана IST суперфамилиясынан тышкары сакталат.
Бул SPACA6дагы эң аз аныкталуучу экинчи структуралык элементтери менен эң кичинекей аймак болсо да, көптөгөн шарнир чөлкөмүнүн калдыктары (анын ичинде 3-аймак) SPACA6 гомологдорунун арасында өтө сакталган, бул спирал байламтасынын жана β-сэндвичтин багыты роль ойноорун көрсөтөт.консерватор катары.Бирок, SPACA6 жана IZUMO1 шарнириндеги кеңири суутек байланышына жана электростатикалык тармактарга карабастан, ички ийкемдүүлүктүн далилин IZUMO137,43,44 бир нече уруксат берилген структуралардын тегиздөөсүнөн көрүүгө болот.Жеке домендердин тегиздөөсү жакшы эле бири-бирине дал келген, бирок бири-бирине карата домендердин багыты борбордук огунан 50°тан 70°ка чейин өзгөргөн (сүрөт S16).Эритмедеги SPACA6 конформациялык динамикасын түшүнүү үчүн SAXS эксперименттери жүргүзүлдү (сүрөт S17a, b).SPACA6 эктодоменинин Ab initio реконструкциясы таякча кристалл түзүмүнө (сүр. S18) ылайык келген, бирок Кратки участогу кандайдыр бир деңгээлде ийкемдүүлүктү көрсөттү (сүрөт. S17b).Бул конформация IZUMO1 менен карама-каршы келет, анда байланышпаган белок тордо да, эритмеде да бумеранг формасын алат43.
Өзгөчө ийкемдүү аймакты аныктоо үчүн, суутек-дейтерий алмашуу масса спектроскопиясы (H-DXMS) SPACA6 боюнча аткарылган жана мурда IZUMO143 алынган маалыматтар менен салыштырылган (сүрөт. 7a, b).SPACA6 IZUMO1ге караганда ийкемдүүраак, муну 100 000 с алмашуудан кийин бүт структурадагы дейтерийдин жогорку алмашуусу далилдейт.Эки структурада, шарнир аймагынын C-терминалдык бөлүгү алмашуунун жогорку деңгээлин көрсөтөт, бул, кыязы, бири-бирине салыштырмалуу 4HB жана Ig сыяктуу домендердин чектелген айлануусуна мүмкүндүк берет.Кызыктуусу, 147CDLPLDCP154 калдыктарынан турган SPACA6 шарниринин C-терминалдык бөлүгү өтө сакталган аймак 3 (сүрөт. 6b), балким, домен аралык ийкемдүүлүк SPACA6нын эволюциялык жактан сакталган өзгөчөлүгү экенин көрсөтүп турат.Ийкемдүүлүк талдоосуна ылайык, CD термикалык эритүү маалыматтары SPACA6 (Tm = 51,2 ° C) IZUMO1 (Tm = 62,9 ° C) караганда туруктуу эмес экенин көрсөттү (сүрөт S1e жана S19).
a H-DXMS сүрөттөрү SPACA6 жана b IZUMO1.Дейтерийдин пайыздык алмашуусу көрсөтүлгөн убакыт пункттарында аныкталган.Суутек-дейтерий алмашуунун деңгээли көк түстөн (10%) кызылга (90%) чейин градиенттик шкала боюнча түс менен көрсөтүлөт.Кара кутулар жогорку алмашуу аймактарын билдирет.Кристалл структурасында байкалган 4HB, шарнир жана Ig сымал домендин чек аралары баштапкы ырааттуулуктун үстүндө көрсөтүлгөн.10 сек, 1000 жана 100 000 сек дейтерий алмашуу деңгээли SPACA6 жана IZUMO1 тунук молекулярдык беттерине коюлган тилке диаграммасына түшүрүлгөн.Дейтерий алмашуу деңгээли 50% төмөн болгон конструкциялардын бөлүктөрү ак түстө.50% H-DXMS алмашуу жогору аймактар ​​градиент масштабда түстүү.
CRISPR/Cas9 жана чычкан ген нокаут генетикалык стратегияларын колдонуу сперматозоид менен жумуртканы бириктирүү жана биригүү үчүн маанилүү болгон бир нече факторлорду аныктоого алып келди.IZUMO1-JUNO жана CD9 структурасынын жакшы мүнөздөлгөн өз ара аракеттенүүсүнөн тышкары, гаметалардын биригүүсүнө байланыштуу протеиндердин көбү структуралык жана функционалдык жактан табышмактуу бойдон калууда.SPACA6 биофизикалык жана структуралык мүнөздөмөсү уруктандыруу учурунда адгезия / биригүү молекулярдык табышмак дагы бир бөлүгү болуп саналат.
SPACA6 жана IST суперфамилиясынын башка мүчөлөрү сүт эмүүчүлөр, ошондой эле жеке канаттуулар, сойлоп жүрүүчүлөр жана жерде-сууда жашоочуларда жогорку деңгээлде сакталган көрүнөт;чындыгында, SPACA6 зебра балыгында уруктануу үчүн да талап кылынат деп ойлошот 59. Бул бөлүштүрүү DCST134, DCST234, FIMP31 жана SOF132 сыяктуу белгилүү гамета синтези менен байланышкан протеиндерге окшош, бул факторлор HAP2 жетишсиз (ошондой эле) GCS1 катары белгилүү) протеиндер көп протистердин каталитикалык активдүүлүгүнө жооп берет., өсүмдүктөр жана муунак буттуулар.Уруктанган синтез белоктору 60, 61. SPACA6 менен IZUMO1дин ортосундагы күчтүү структуралык окшоштукка карабастан, бул белоктордун бирин коддоочу гендердин нокауту эркек чычкандардын тукумсуздугуна алып келди, бул алардын гаметалык синтездеги функцияларынын кайталанбагандыгын көрсөтүп турат..Кеңири айтканда, синтездин адгезия фазасы үчүн зарыл болгон белгилүү сперматозоиддердин бири да ашыкча эмес.
SPACA6 (жана IST супер үй-бүлөсүнүн башка мүчөлөрү) гаметикалык түйүндөргө катышабы, биригүү чекиттерине маанилүү протеиндерди тартуу үчүн интрагаметикалык тармактарды түзөбү, же балким, ал тургай, кармалбаган фузогендердин ролун аткарабы, ачык суроо бойдон калууда.HEK293T клеткаларындагы Co-иммунопреципитациялык изилдөөлөр толук узундуктагы IZUMO1 жана SPACA632 ортосундагы өз ара аракеттенүүнү көрсөттү.Бирок, биздин рекомбинантты эктодомендер in vitro менен өз ара аракеттенген жок, бул Noda et al.конструкцияда экөө тең жок кылынган (уруктандыруу үчүн керексиз болгон IZUMO1дин цитоплазмалык куйругуна көңүл буруңуз62).Же болбосо, IZUMO1 жана/же SPACA6 башка белокторду (белгилүү же ачыла элек) камтыган физиологиялык спецификалык конформациялар же молекулярдык комплекстер сыяктуу биз in vitro көбөйтпөй турган атайын байланыштыруучу чөйрөлөрдү талап кылышы мүмкүн.IZUMO1 эктодомени перивителлиндик мейкиндикте сперматозоиддердин жумурткага кошулушуна ортомчулук кылат деп эсептелгени менен, SPACA6 эктодоменинин максаты түшүнүксүз.
SPACA6 түзүмү протеин-белок өз ара катышы мүмкүн болгон бир нече сакталган беттерди ачып берет.CXXC мотивине дароо жанаша жайгашкан шарнир чөлкөмүнүн сакталган бөлүгү (жогоруда 1-патч деп аталат) бир нече сыртты караган жыпар жыттуу калдыктарга ээ, алар көбүнчө биомолекулалардын ортосундагы гидрофобдук жана π-үйлөшүүчү өз ара аракеттенишүүлөр менен байланышкан.Ig сымал домендин (2-регион) кенен капталдары жогорку сакталган Arg жана Анын калдыктары менен оң заряддуу оюкту түзөт жана бул аймакка каршы антителолор мурда гамета биригүүсүнө 30 бөгөт коюу үчүн колдонулган.Антитело алты аргинин калдыктарынын үчөөнө ээ жана His220 жогорку деңгээлде сакталган 212RIRPAQLTHRGTFS225 сызыктуу эпитопун тааныйт.Дисфункциянын бузулушу ушул конкреттүү калдыктардын же бүтүндөй аймактын бөгөттөлүшүнө байланыштуубу, так эмес.Бул боштуктун β-сэндвичтин С-терминусуна жакын жайгашуусу кошуна сперматозоиддердин белоктору менен cis-өз ара аракеттенүүсүн көрсөтөт, бирок ооцит белоктору менен эмес.Андан тышкары, шарнирдин ичинде өтө ийкемдүү пролинге бай чырпыктын (3-сайт) кармалышы белок-белок өз ара аракеттенүү жери болушу мүмкүн же, кыязы, эки домендин ортосундагы ийкемдүүлүктүн сакталышын көрсөтөт.Gender SPACA6 белгисиз ролу үчүн маанилүү.гаметалардын синтези.
SPACA6 клеткалар аралык адгезия белокторунун, анын ичинде Ig сымал β-сэндвичтердин касиеттерине ээ.Көптөгөн жабышчаак протеиндер (мисалы, кадриндер, интегриндер, адгезиндер жана IZUMO1) бир же бир нече β-сэндвич доменине ээ, алар клетка мембранасынан протеиндерди экологиялык максаттарга чейин кеңейтет63,64,65.SPACA6нын Ig сымал домени ошондой эле көбүнчө адгезия жана когезия β-сэндвичтеринде кездешүүчү мотивди камтыйт: β-сэндвичтердин учтарындагы параллелдүү жиптердин дублеттери, механикалык кыскычтар66 деп аталат.Бул мотив клеткалар аралык өз ара аракеттенишүүгө катышкан белоктор үчүн баалуу болгон, кесүү күчтөрүнө каршылыкты жогорулатат деп эсептелет.Бирок, адгезиндерге бул окшоштугуна карабастан, SPACA6 жумуртканын агы менен өз ара аракеттенишине эч кандай далил жок.SPACA6 эктодомени JUNO менен байланыша албайт жана SPACA6-экспрессиялоочу HEK293T клеткалары, бул жерде көрсөтүлгөндөй, зона 32 жок ооциттер менен дээрлик өз ара аракеттенишет.Эгерде SPACA6 гаметикалык байланыштарды түзсө, анда бул өз ара аракеттенүү пост-котормолорду талап кылышы же башка сперматозоиддердин белоктору менен турукташуусу мүмкүн.Акыркы гипотезаны колдоо үчүн, IZUMO1 жетишсиз сперматозоид IZUMO1 башка молекулалар гамета адгезия кадам 27 тартылган экенин көрсөтүп, ооциттерге байланыштырат.
Көптөгөн вирустук, клеткалык жана өнүгүү синтездик протеиндердин фузогендер катары функцияларын алдын ала айткан касиеттери бар.Мисалы, вирустун синтездик гликопротеиндеринде (I, II жана III класстар) кабыл алуучунун мембранасына киргизилген протеиндин аягында гидрофобдук синтез пептиддери же цикли болот.IZUMO143 гидрофилдүүлүк картасы жана IST суперфамилиясынын түзүмү (аныкталган жана болжолдонгон) эч кандай айкын гидрофобдук синтез пептиддерин көрсөткөн.Ошентип, эгерде IST супер үй-бүлөсүндө кандайдыр бир белоктор фузогендер катары иштешсе, алар муну башка белгилүү мисалдардан айырмаланып аткарышат.
Жыйынтыктап айтканда, гаметалардын синтези менен байланышкан белоктун IST суперфамилиясынын мүчөлөрүнүн функциялары таң калыштуу сыр бойдон калууда.Биздин мүнөздөлгөн SPACA6 рекомбинанттык молекуласы жана анын чечилген структурасы бул жалпы түзүмдөрдүн ортосундагы мамилелерди жана гаметалардын биригүүдөгү жана биригүүдөгү ролун түшүнүүгө жардам берет.
Адамдын болжолдонгон SPACA6 эктодоменине туура келген ДНК ырааттуулугу (NCBI кошулуу номери NP_001303901.1; калдыктар 27–246) Drosophila melanogaster S2 клеткаларында экспрессиялоо үчүн кодон оптималдаштырылган жана ырааттуулук менен ген фрагменти катары синтезделген Kozakurofinding (Ecofinding) менен., BiP секреция сигналы жана тиешелүү 5′ жана 3′ учтары бул генди ligation көз карандысыз клондоо үчүн pMT экспрессия векторунун негизинде puromycin (pMT-puro) менен тандоо үчүн өзгөртүлгөн metallothionein промоутер.pMT-puro вектору 10x-His C-терминал теги менен коштолгон тромбиндин ажыраган жерин коддойт (сүрөт S2).
D. melanogaster S2 (Gibco) клеткаларына SPACA6 pMT-puro векторунун туруктуу трансфекциясы IZUMO1 жана JUNO43 үчүн колдонулган протоколго окшош эле аткарылган.S2 клеткалары эрип, Шнайдер чөйрөсүндө (Гибко) өстүрүлгөн, акыркы концентрациясы 10% (көлөм/көлөм) жылуулук менен инактивдештирилген түйүлдүктүн музоо сывороткасы (Гибко) жана 1X антимикотик антибиотик (Гибко).Эрте өтүүчү клеткалар (3,0 х 106 клеткалар) 6-кудук плиталардын (Корнинг) жеке кудуктарына капталган.27°Cде 24 саат инкубациялоодон кийин клеткалар өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык SPACA6 pMT-puro векторунун 2 мг аралашмасы жана Effectene трансфекциялык реагент (Qiagen) менен трансфекцияланган.Трансфекцияланган клеткалар 72 саат инкубацияланган жана андан кийин 6 мг/мл пуромицин менен жыйналган.Андан кийин клеткалар толук Шнайдердин чөйрөсүнөн бөлүнүп алынып, ири өлчөмдөгү белок өндүрүү үчүн сывороткасыз Insect-XPRESS чөйрөсүнө (Лонза) жайгаштырылды.S2 клетка культурасынын 1 л партиясы 2 л желдетилген жалпак түбү бар полипропилен эрленмейер колбада 8–10 × 106 мл-1 клеткага чейин өстүрүлүп, андан соң 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) акыркы концентрациясы менен стерилизацияланган жана стерилдүү чыпкаланган.индукцияланган.Индукцияланган культуралар төрт күн бою 27° C. 120 айн/минутта инкубацияланган.
SPACA6 камтыган шарттуу чөйрө 4°Cде 5660×g центрифугалоо жолу менен бөлүнүп алынган, андан кийин Centramate тангенциалдык агымын чыпкалоо системасы (Pall Corp) 10 кДа MWCO мембранасы менен.SPACA6 камтыган концентрацияланган чөйрөнү 2 мл Ni-NTA агароз чайырына (Qiagen) колонкага колдонуңуз.Ni-NTA чайырын 10 колонна көлөмү (CV) буфер А жана андан кийин 1 CV A буфери менен жууп, 50 мМ имидазолдун акыркы концентрациясын берди.SPACA6 500 мМ акыркы концентрацияга чейин имидазол менен толукталган 10 мл буфер А менен элюцияланган.Чектөө классы тромбин (Millipore Sigma) түздөн-түз диализ түтүгүнө (MWCO 12-14 кДа) 1 бирдикте мг SPACA6 каршы 1 L 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5 жана 150 мМ NaCl (буфер B) кошулду.) 4°С 48 саат бою.Андан кийин тромбин менен бөлүнгөн SPACA6 туздун концентрациясын азайтуу үчүн үч эсе суюлтулган жана 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 менен теңдештирилген 1 мл MonoS 5/50 GL катион алмашуу колонкасына (Cytiva/GE) жүктөлгөн.Катион алмаштыргыч 3 CV 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 менен жуулчу, андан кийин SPACA6 0 дан 500 мМ NaClге чейинки сызыктуу градиент менен 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 25 CV үчүн элюцияланган.Ион алмашуу хроматографиясынан кийин, SPACA6 1 млге чейин концентрацияланган жана B буфери менен теңдештирилген ENrich SEC650 10 x 300 колонкасынан (BioRad) изократиялык түрдө элюталанган. Хроматограммага ылайык, SPACA6 камтыган бассейн жана концентрат фракциялары.Тазалык 16% SDS-полиакриламиддик гелде Coomassie боёгон электрофорез аркылуу көзөмөлдөндү.Белоктун концентрациясы Бир-Ламберт мыйзамын жана теориялык молярдык өчүп кетүү коэффициентин колдонуу менен 280 нм абсорбент аркылуу сандык аныкталды.
Тазаланган SPACA6 10 мМ натрий фосфатына, рН 7.4 жана 150 мМ NaFга каршы түнү диализдешти жана CD спектроскопиясы менен анализдөөнүн алдында 0.16 мг/мл чейин суюлтулду.Толкун узундугу 185тен 260 нмге чейинки компакт-дискілерди спектралдык сканерлөө Jasco J-1500 спектрополяриметринде 1 мм оптикалык жолдун узундугу (Helma) менен кварц кюветтерин колдонуу менен 25°C 50 нм/мин ылдамдыкта чогултулган.CD спектрлери баштапкы оңдолуп, 10 алуудан ашык орточо алынган жана см2/дмоль градустарында орточо калдык эллиптикалыкка (θMRE) айландырылган:
мында MW - Да ар бир үлгүнүн молекулалык салмагы;N – аминокислоталардын саны;θ - миллиградустагы эллиптикалык;d оптикалык жолдун см менен узундугуна туура келет;белоктун концентрациясы бирдикте.