304 Дат баспас болоттон жасалган ширетүү ширетилген ширетилген түтүк / түтүк гемикалык зомпонент, Глобалдык деңиз микробиомунун биосинтетикалык потенциалы

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Ар бир слайдда үч макала көрсөтүлгөн слайдерлер.Слайддар аркылуу өтүү үчүн артка жана кийинки баскычтарды же ар бир слайд аркылуу жылуу үчүн аягындагы слайд контроллер баскычтарын колдонуңуз.

Продукциянын толук сүрөттөлүшү

304 Дат баспас болоттон жасалган ширетилген бурчтуу түтүк / түтүк
1. Өзгөчөлүгү: Дат баспас болоттон жасалган катушка түтүк / түтүк
2. Түрү: ширетилген же тиксиз
3. Стандарт: ASTM A269, ASTM A249
4. Дат баспас болоттон жасалган катушка түтүк OD: 6мм 25.4MM үчүн
5. Length: 600-3500MM же кардардын талабы боюнча.
6. Дубалдын калыңдыгы: 0,2ммден 2,0ммге чейин.

7. Толеранттуулук: OD: +/- 0.01mm;Калыңдыгы: +/-0,01%.

8. Катушканын ички тешик өлчөмү: 500MM-1500MM (кардардын талаптарына ылайык жөнгө салынышы мүмкүн)

9. Катушканын бийиктиги: 200MM-400MM (кардардын талаптарына ылайык жөнгө салынышы мүмкүн)

10. Бети: Жаркыраган же күйдүрүлгөн
11. Материал: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, эритме 625, 825, 2205, 2507, ж.б.
12. Packing: жыгач учурда токулган баштыктар, жыгач паллет, жыгач шахта, же кардардын талабы боюнча
13. Сыноо : химиялык компоненти, кирешелүүлүгү, чыңалуу күчү, катуулугун өлчөө
14. Кепилдик: Үчүнчү тарап (мисалы: SGS TV ) текшерүү, ж.б.
15. Колдонмо: жасалгалоо, эмерек, мунай ташуу, жылуулук алмаштыргыч, тосмолор кабыл алуу, кагаз даярдоо, унаа, тамак-аш кайра иштетүү, медициналык, ж.б.

Табигый микробдук жамааттар филогенетикалык жана зат алмашуу жагынан ар түрдүү.Организмдердин аз изилденген топторунан тышкары1, бул көп түрдүүлүк экологиялык жана биотехнологиялык жактан маанилүү ферменттерди жана биохимиялык кошулмаларды2,3 ачуу үчүн бай потенциалга ээ.Бирок, мындай кошулмаларды синтездөөчү геномдук жолдорду аныктоо үчүн бул көп түрдүүлүктү изилдөө жана аларды тиешелүү хосттору менен байланыштыруу кыйынчылык бойдон калууда.Ачык океандагы микроорганизмдердин биосинтетикалык потенциалы глобалдык масштабда бүт геномдун резолюциясынын маалыматтарын талдоодогу чектөөлөрдөн улам белгисиз бойдон калууда.Бул жерде биз океандагы биосинтетикалык ген кластерлеринин көп түрдүүлүгүн жана ар түрдүүлүгүн культураланган клеткалардан жана жалгыз клеткалардан 10 000ге жакын микробдук геномду 1000ден ашуун деңиз суусунун үлгүлөрүнүн 25 000ден ашык жаңы реконструкцияланган геномдору менен интеграциялоо аркылуу изилдейбиз.Бул аракеттер 40 000ге жакын болжолдуу, негизинен жаңы биосинтетикалык ген кластерлерин аныктады, алардын айрымдары мурда белгисиз филогенетикалык топтордо табылган.Бул популяцияларда биз өстүрүлбөгөн бактерия филумуна кирген жана бул чөйрөдө биосинтетикалык жактан ар түрдүү микроорганизмдердин айрымдарын камтыган биосинтетикалык ген кластерлерине байытылган тукумду аныктадык («Candidatus Eudormicrobiaceae»).Алардын ичинен биз фосфатаза-пептиддик жана питонамид жолдорун мүнөздөп, тиешелүүлүгүнө жараша өзгөчө биоактивдүү кошулма түзүмүнүн жана энзимологиянын учурларын аныктадык.Жыйынтыктап айтканда, бул изилдөө микробиомага негизделген стратегиялар жакшы түшүнүлбөгөн микробиотада жана чөйрөдө мурда сүрөттөлбөгөн ферменттерди жана табигый азыктарды изилдөөгө кантип жардам бере аларын көрсөтөт.
Микробдор глобалдык биогеохимиялык циклдерди ишке ашырат, тамак-аш түйүндөрүн сактап, өсүмдүктөр менен жаныбарлардын ден соолугун сактайт5.Алардын эбегейсиз филогенетикалык, метаболикалык жана функционалдык ар түрдүүлүгү жаңы таксондорду1, ферменттерди жана биохимиялык кошулмаларды, анын ичинде табигый продуктуларды6 ачуу үчүн бай потенциалды билдирет.Экологиялык жамааттарда бул молекулалар микроорганизмдерге ар кандай физиологиялык жана экологиялык функцияларды, байланыштан атаандаштыкка чейин камсыз кылат 2, 7.Баштапкы функцияларынан тышкары, бул табигый продуктулар жана алардын генетикалык коддолгон өндүрүш жолдору биотехнологиялык жана терапиялык колдонмолор үчүн мисалдарды берет2,3.Мындай жолдорду жана байланыштарды аныктоого өстүрүлгөн микробдорду изилдөө бир топ жардам берди.Бирок табигый чөйрөнүн таксономикалык изилдөөлөрү микроорганизмдердин басымдуу көпчүлүгү өстүрүлбөгөнүн көрсөттү8.Бул маданий тенденция биздин көптөгөн микробдор тарабынан коддолгон функционалдык ар түрдүүлүктү колдонуу мүмкүнчүлүгүбүздү чектейт4,9.
Бул чектөөлөрдү жоюу үчүн, акыркы он жылдагы технологиялык жетишкендиктер изилдөөчүлөргө түз (б.а., алдын ала маданиятсыз) бүт жамааттардан (метогеномика) же бир клеткадан микробдук ДНК фрагменттерин ырааттуулук менен тизүүгө мүмкүндүк берди.Бул фрагменттерди чоңураак геномдун фрагменттерине чогултуу жана бир нече метагеномикалык чогултулган геномдорду (MAGs) же бир күчөтүлгөн геномдорду (SAGs) реконструкциялоо мүмкүнчүлүгү, тиешелүүлүгүнө жараша, микробиоманы (б.а. микробдук жамааттарды жана микробиоманы) таксоцентрдик изилдөөлөр үчүн маанилүү мүмкүнчүлүк ачат.жаңы жолдорду ачуу.берилген чөйрөдө өзүнүн генетикалык материалы) 10,11,12.Чынында эле, акыркы изилдөөлөр жер бетиндеги микробдук ар түрдүүлүктүн филогенетикалык өкүлчүлүгүн кыйла кеңейтти1, 13 жана мурда культураланган микроорганизмдердин шилтеме геномунун тизмектери (REFs) менен камтылбаган айрым микробдук жамааттардагы функционалдык көп түрдүүлүктүн көбүн ачты14.Ачылбаган функционалдык ар түрдүүлүктү кабыл алуучу геномдун контекстинде жайгаштыруу жөндөмдүүлүгү (б.а. геномдун резолюциясы) жаңы табигый продуктуларды коддогон али мүнөздөлбөгөн микробдук линияларды болжолдоодо15,16 же мындай кошулмаларды алардын баштапкы өндүрүүчүсүнө чейин издөө үчүн абдан маанилүү.Мисалы, айкалыштырылган метагеномдук жана бир клеткалуу геномдук талдоо ыкмасы зат алмашуу жагынан бай губка менен байланышкан бактериялардын тобун Candidatus Entotheonella аныктоого алып келди, ар кандай дары потенциалдарын өндүрүүчүлөр18.Бирок, ар түрдүү микробдук жамааттарды геномдук изилдөө боюнча акыркы аракеттерге карабастан, 16,19 Жердеги экосистемалардын эң чоң океаны 16,20 үчүн глобалдык метагеномикалык маалыматтардын үчтөн экисинен ашыгы дагы эле жок.Ошентип, жалпысынан, деңиз микробиомунун биосинтетикалык потенциалы жана анын жаңы ферменттик жана табигый продуктулардын репозиторийи катары потенциалы негизинен изилденбеген бойдон калууда.
Деңиз микробиомаларынын биосинтетикалык потенциалын глобалдык масштабда изилдөө үчүн биз адегенде филогенетика жана ген функциясынын кеңири маалымат базасын түзүү үчүн маданиятка көз каранды жана маданиятсыз ыкмаларды колдонуу менен алынган деңиз микробунун геномдорун бириктирдик.Бул маалымат базасын текшерүү биосинтетикалык ген кластерлеринин (BGCs) көп түрдүүлүгүн аныктады, алардын көпчүлүгү али мүнөздөлбөгөн ген кластердик (GCF) үй-бүлөлөргө таандык.Мындан тышкары, биз бүгүнкү күнгө чейин ачык океандагы BGCs эң белгилүү ар түрдүүлүгүн көрсөткөн белгисиз бактериялык үй-бүлөнү аныктадык.Биз эки рибосомалык синтез жана пост-translationally өзгөртүлгөн пептид (RiPP) жолдорун учурда белгилүү жолдордон алардын генетикалык айырмачылыктарынын негизинде эксперименталдык валидация үчүн тандап алган.Бул жолдордун функционалдык мүнөздөмөсү энзимологиянын күтүлбөгөн мисалдарын, ошондой эле протеаза ингибитордук активдүүлүгү менен структуралык адаттан тыш кошулмаларды ачты.
Алгач биз анын бактериялык жана археалдык компоненттерине көңүл буруп, геномду анализдөө үчүн глобалдык маалымат ресурсун түзүүнү максат кылдык.Бул максатта, биз метагеномикалык маалыматтарды жана 1038 деңиз суусунун үлгүлөрүн глобалдык бөлүштүрүлгөн 215 үлгү алуу сайттарынан (кеңдик диапазону = 141,6 °) жана бир нече терең катмарлардан (пелагиялык, мезопелагиялык жана абиссалдык зоналарды камтыган 1ден 5600 мге чейин) чогулттук.Фонду 21,22,23 (сүрөт 1а, кеңейтилген маалыматтар, 1а-сүрөт жана кошумча таблица 1).Кеңири географиялык камтууну камсыз кылуудан тышкары, бул тандалма чыпкаланган үлгүлөр бизге деңиз микробиомасынын түрдүү компоненттерин, анын ичинде вируска бай (<0,2 мкм), прокариотко бай (0,2–3 мкм), бөлүкчөлөргө бай (0,8 мкм) салыштырууга мүмкүндүк берди. ).–20 мкм) жана вирусу жок (>0,2 мкм) колониялар.
а, Деңиз микробдук жамааттарынын жалпы 1038 жалпыга жеткиликтүү геномдору (метогеномикасы) глобалдык бөлүштүрүлгөн 215 жерден (62°Стен 79°Ш.га чейин жана 179°Вттен 179°Еге чейин.) чогултулган.Карта плиткалары © Esri.Булактары: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ жана Esri.б, бул метагеномдор маалымат топтомдорунда (түс менен белгиленген) саны жана сапаты (ыкмалары) боюнча айырмаланган MAGлерди (методдор жана кошумча маалымат) реконструкциялоо үчүн колдонулган.Реконструкцияланган MAGлер жалпыга жеткиликтүү (тышкы) геномдор менен толукталды, анын ичинде колго жасалган MAG26, SAG27 жана REF.27 Compile OMD.c, SAG (GORG) 20 же MAG (GEM) 16га гана негизделген мурунку отчеттор менен салыштырганда, OMD деңиз микробдук жамааттарынын геномдук мүнөздөмөсүн (метогеномикалык окуу картасы; метод) эки-үч эсеге жакшыртат жана тереңирээк ырааттуу көрсөтүү менен эки-үч эсеге жакшырат. кеңдик..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD түрлөрүнүн кластерлеринин деңгээли (95% орточо нуклеотиддердин окшоштугу) жалпы санын аныктайт. болжол менен 8300 түр, алардын жарымынан көбү мурда GTDB (89-версия) колдонуу менен таксономиялык аннотацияларга ылайык мүнөздөлгөн эмес, e, геномдун түрү боюнча түрлөрдүн классификациясы MAG, SAG жана REFs филогенетикалык көп түрдүүлүктү чагылдырууда бири-бирин жакшы толуктай турганын көрсөттү. деңиз микробиомасы.Тактап айтканда, түрлөрдүн 55%, 26% жана 11% тиешелүүлүгүнө жараша MAG, SAG жана REF үчүн өзгөчө болгон.BATS, Бермуд Атлантикалык убакыт сериясы;GEM, Жер микробиомасынын геномдору;GORG, глобалдык океан шилтеме геному;HOT, Гавайи океанынын убакыт сериясы.
Бул маалымат топтомун колдонуп, биз жалпысынан 26,293 MAGди, негизинен бактериялык жана археалдыкты калыбына келтирдик (сүрөт 1b жана кеңейтилген маалыматтар, 1б-сүрөт).Биз бул MAGлерди ар кандай жерлерден же убакыт чекиттеринен (ыкмаларынан) үлгүлөрдүн ортосундагы табигый ырааттуулук вариациясынын кыйрашына жол бербөө үчүн бириктирилген метагеномикалык үлгүлөрдөн эмес, өзүнчө жыйындардан түздүк.Мындан тышкары, биз геномдук фрагменттерди алардын көп сандагы үлгүлөрдөгү таралуу корреляциясынын негизинде топтоштурдук (сурамжылоого жараша 58ден 610 үлгүгө чейин; метод).Бул көп убакытты талап кылган, бирок маанилүү кадам24 экенин аныктадык, ал бир нече масштабдуу MAG16, 19, 25 реконструкциялоо иштеринде өткөрүп жиберилген жана анын санын (орточо эсеп менен 2,7 эсеге) жана сапатын (орто эсеп менен + 20%) жакшыртат. геном.бул жерде изилденген деңиз метагеномунан реконструкцияланган (кеңейтилген маалыматтар, 2а-сүрөт жана кошумча маалымат).Жалпысынан, бул аракеттердин натыйжасында деңиз микробдук MAGs 4,5 эсеге көбөйдү (эгерде жогорку сапаттагы MAGлер гана каралса, 6 эсеге), бүгүнкү күндө бар болгон эң кеңири MAG ресурсуна салыштырмалуу16 (методдор).Бул жаңы түзүлгөн MAG топтому андан кийин колго тандалып алынган 830 MAG26, 5969 SAG27 жана 1707 REF менен бириктирилген.Деңиз бактерияларынын жана архейлердин жыйырма жети түрү 34 799 геномдон турган комбинатордук коллекцияны түзгөн (сүрөт 1б).
Андан кийин биз жаңы түзүлгөн ресурстун деңиз микробдук жамааттарын көрсөтүү жөндөмүн жакшыртуу жана ар кандай геном түрлөрүн интеграциялоонун таасирин баалоо үчүн бааладык.Орточо алганда, биз ал деңиздеги метагеномикалык маалыматтардын болжол менен 40-60% камтыганын таптык (Figure 1c), тереңдикте жана кеңдикте мурунку MAG гана отчетторунан эки-үч эсеге көбүрөөк. Серия 16 же SAG20.Кошумчалай кетсек, белгиленген коллекциялардагы таксономиялык ар түрдүүлүктү системалуу түрдө өлчөө үчүн биз Геномдук таксономия базасынын (GTDB) инструменттерин (ыкмаларын) колдонуп, бардык геномдорго түшүндүрмө бердик жана геном боюнча нуклеотиддердин бирдейлигин 95% колдондук.28 8304 түрдүн кластерлерин (түрлөрдү) аныктоо үчүн.Бул түрлөрдүн үчтөн экиси (анын ичинде жаңы класстар) мурда GTDBде пайда болгон эмес, анын ичинен 2790 бул изилдөөдө реконструкцияланган MAG аркылуу ачылган (сүрөт 1d).Мындан тышкары, биз геномдун ар кандай түрлөрү өтө толуктап экенин байкадык: 55%, 26% жана 11% түрлөр толугу менен MAG, SAG жана REF турат (сүрөт 1e).Мындан тышкары, MAG суу тилкесинде табылган бардык 49 түрдү камтыды, ал эми SAG жана REF тиешелүүлүгүнө жараша, алардын 18 жана 11ин гана көрсөттү.Бирок, SAG эң кеңири таралган класстардын ар түрдүүлүгүн (кеңейтилген маалыматтар, 3а-сүрөт) жакшыраак чагылдырат, мисалы, Pelagic Baceriales (SAR11), SAG дээрлик 1300 түрдү жана MAG 390 гана түрдү камтыйт.Белгилей кетчү нерсе, REFs түр деңгээлинде MAG же SAG менен сейрек кайталанган жана бул жерде изилденген ачык океандагы метагеномикалык топтомдордо кездешпеген 1000ге жакын геномдун >95% түзгөн, бул негизинен обочолонгон репрезентативдик деңиз үлгүлөрүнүн башка түрлөрү (мисалы, чөкмөлөр) менен өз ара аракеттенүүсүнө байланыштуу. .же кабыл алуучу).Аны илимий коомчулукка кеңири жеткирүү үчүн классификацияланбаган фрагменттерди (мисалы, болжолдонгон фагдардан, геномдук аралдардан жана MAG реконструкциясы үчүн маалыматтар жетишсиз болгон геном фрагменттеринен) камтыган бул деңиз геномунун ресурсун таксономиялык маалыматтар менен салыштырууга болот. .Океан микробиология маалымат базасында (OMD; https://microbiomics.io/ocean/) ген функциясы жана контексттик параметрлер менен аннотацияларга кириңиз.
Андан кийин биз ачык океан микробиомдорундагы биосинтетикалык потенциалдын байлыгын жана жаңылыгын изилдөөгө кириштик.Бул максатта, биз биринчи жолу 39,055 BGCs болжолдоо үчүн 1038 деңиз метагеномдорунда (ыкмаларында) табылган бардык MAGs, SAGs жана REFs үчүн antiSMASH колдондук.Андан кийин биз аларды 6907 ашыкча эмес GCF жана 151 ген кластер популяциясына (GCCs; Кошумча 2-таблица жана методдор) топтоштурдук (б.а., ошол эле BGC бир нече геномдо коддолушу мүмкүн) жана концентрацияланган BGCлердин метагеномикалык маалыматтарын фрагментациялоо.Толук эмес BGCs, эгерде бар болсо (Кошумча маалымат) олуттуу көбөйгөн жок, тиешелүүлүгүнө жараша, 44% жана 86% учурларда жок дегенде бир бүтүн BGC мүчөсүн камтыган GCFs жана GCCs саны.
GCC деңгээлинде биз болжолдонгон RiPPs жана башка табигый өнүмдөрдүн кеңири түрүн таптык (сүрөт 2а).Алардын арасында, мисалы, арилполиендер, каротиноиддер, эктоиндер жана сидерофордор филогенетикалык кеңири таралышы жана океандык метагеномдорунун көптүгү менен ГККга кирет, бул микроорганизмдердин деңиз чөйрөсүнө кеңири адаптациялангандыгын, анын ичинде реактивдүү кычкылтектин түрлөрүнө туруктуулугун көрсөтөт. кычкылдануу жана осмостук стресс..же темирди сиңирүү (кошумча маалымат).Бул функционалдык көп түрдүүлүк NCBI RefSeq маалымат базасында (BiG-FAM/RefSeq, мындан ары RefSeq деп аталат)29 сакталган болжол менен 190 000 геномдун ичинен болжол менен 1,2 миллион BGC анализинен карама-каршы келет, бул рибосомалык эмес Синтетаза пептиддери жана NR поликеттери (NR) (PKS) BGCs (Кошумча маалымат).Биз ошондой эле 44 (29%) GCC ар кандай RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; Сүрөт 2a жана методдор) менен алыстан байланышкан жана 53 (35%) GCCди MAGде гана таптык, бул потенциалды баса белгилеген. OMDде мурда сүрөттөлбөгөн химиялык заттарды табуу үчүн.Бул GCC ар бири өтө ар түрдүү биосинтетикалык функцияларды чагылдырарын эске алып, биз окшош табигый продуктуларды коддоо үчүн болжолдонгон BGCтердин деталдуу тобун камсыз кылуу максатында GCF деңгээлинде маалыматтарды андан ары талдап чыктык29.Бардыгы болуп 3861 (56%) аныкталган GCFs RefSeq менен дал келген эмес жана >97% GCFs эксперименталдык жактан тастыкталган BGCлердин эң чоң маалымат базаларынын бири болгон MIBiGде болгон эмес (2б-сүрөт).Референдум геному менен жакшы көрсөтүлбөгөн орнотуулардагы көптөгөн потенциалдуу жаңы жолдорду табуу таң калыштуу эмес болсо да, салыштыруудан мурун BGCлерди GCFтерге түшүрүү методубуз мурунку отчеттордон айырмаланат 16 жана бизге жаңылыкка калыс баа берүүгө мүмкүндүк берет.Жаңы көп түрдүүлүктүн көпчүлүгү (3012 GCF же 78%) болжолдонгон терпендерге, RiPPке же башка табигый продуктыларга туура келет, ал эми көпчүлүгү (1815 GCF же 47%) биосинтетикалык потенциалынан улам белгисиз типтерде коддолгон.PKS жана NRPS кластерлеринен айырмаланып, бул компакттуу BGCs метагеномикалык чогулуш 31 учурунда фрагменттүү болуу ыктымалдыгы аз жана алардын продуктуларынын көп убакытты жана ресурсту талап кылган функциялык мүнөздөмөсүнө мүмкүнчүлүк берет.
Жалпысынан 39 055 BGC 6 907 GCF жана 151 GCC болуп топтолгон.а, маалыматтарды көрсөтүү (ички тышкы).GCC негизинде BGC аралыктарынын иерархиялык кластерлери, алардын 53ү MAG тарабынан гана белгиленет.GCC ар кандай таксондордон (ln-трансформацияланган дарбаза жыштыгы) жана ар кандай BGC класстарынан (тегеректин өлчөмү анын жыштыгына туура келет) BGCлерди камтыйт.Ар бир GCC үчүн сырткы катмар BGC санын, таралышын (үлгүлөрдүн пайызы) жана аралыкты (минималдуу BGC косинус аралыкты (min(dMIBiG))) BiG-FAMдан BGCге чейин) көрсөтөт.Эксперименталдык жактан текшерилген BGC (MIBiG) менен тыгыз байланышкан BGC менен GCCs жебелер менен белгиленет.b GCFти болжолдонгон (BiG-FAM) жана эксперименталдык жактан тастыкталган (MIBiG) BGCs менен салыштырып, 3861 жаңы (d–>0,2) GCF табылды.Бул коддордун көбү (78%) RiPP, терпендер жана башка болжолдуу табигый продуктулар үчүн.в, 1038 деңиз метагеномдорунда табылган OMDдеги бардык геномдор OMDнун филогенетикалык камтылышын көрсөтүү үчүн GTDB базалык дарагына жайгаштырылган.OMDде эч кандай геному жок кладдар боз түстө көрсөтүлгөн.BGC саны берилген класстагы геномдо болжолдонгон BGCлердин эң көп санына туура келет.Тактык үчүн, түйүндөрдүн акыркы 15% кыйрады.Жебелер микобактерияны, Гордонияны (родококктан кийинки экинчи) жана крокосфераны (Синехококктан кийинки экинчи) кошпогондо, BGC (>15 BGC) бай класстарды көрсөтөт.г, белгисиз в.Eremiobacterota биосинтетикалык көп түрдүүлүктү көрсөттү (табигый продуктунун түрүнө негизделген Шеннон индекси).Ар бир тилке түрдөгү эң көп BGC менен геномду билдирет.T1PKS, PKS түрү I, T2/3PKS, PKS түрү II жана түрү III.
Байлык жана жаңылыктан тышкары, биз деңиз микробиомасынын биосинтетикалык потенциалынын биогеографиялык түзүлүшүн изилдейбиз.Үлгүлөрдү орточо метагеномдук GCF көчүрмөлөрүнүн санын бөлүштүрүү (методдор) боюнча топтоо төмөнкү кеңдиктеги, жер үстүндөгү, прокариотко бай жана вируска начар жамааттар, негизинен жер үстүндөгү же тереңирээк күн тийген суулардан, RiPP жана BGC терпендерине бай экендигин көрсөттү.Ал эми, полярдык, терең деңиздеги, вируска жана бөлүкчөлөргө бай жамааттар NRPS жана PKS BGCдин көптүгү менен байланышкан (кеңейтилген маалыматтар, 4-сүрөт жана кошумча маалымат).Акыр-аягы, биз жакшы изилденген тропикалык жана пелагикалык жамааттар жаңы терпендердин эң келечектүү булактары экенин таптык (Кошумча маалымат сүрөтү).PKS, RiPP жана башка табигый продуктулар үчүн эң жогорку потенциал (кеңейтилген маалыматтар менен 5а-сүрөт).
Деңиз микробиомаларынын биосинтетикалык потенциалын изилдөөбүздү толуктоо үчүн биз алардын филогенетикалык таралышынын картасын түзүүнү жана BGC менен байытылган жаңы класстарды аныктоону максат кылдык.Ушул максатта, биз деңиз микробдорунун геномдорун нормалдаштырылган GTDB13 бактериялык жана археалдык филогенетикалык даракка жайгаштырдык жана алар коддогон болжолдуу биосинтетикалык жолдорду каптадык (сүрөт 2c).Биз цианобактериялар (Synechococcus) жана Tistrella32,33 сыяктуу Proteus бактериялары сыяктуу биосинтетикалык потенциалы менен белгилүү деңиз сууларынын үлгүлөрүндө (ыкмаларында) BGC менен байытылган бир нече класстарды (15тен ашык BGC менен көрсөтүлгөн) оңой аныктадык же жакында эле алардын көңүлүн бурду. табигый продуктулар.мисалы, Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus жана Planctomycetota34,35,36.Кызыгы, биз бул катмарлардан мурда изилденбеген бир нече тукумду таптык.Мисалы, Planctomycetota жана Myxococcota филасында эң бай биосинтетикалык потенциалы бар түрлөр, тиешелүүлүгүнө жараша, мүнөздөлбөгөн талапкер отряддарына жана тукумдарына таандык болгон (Кошумча таблица 3).Чогуу алганда, бул OMD мурда белгисиз филогенетикалык маалыматка, анын ичинде микроорганизмдерге жетүү мүмкүнчүлүгүн камсыздайт, алар ферменттерди жана табигый продуктуларды табуу үчүн жаңы максаттарды көрсөтөт.
Андан кийин, биз BGC менен байытылган классты анын мүчөлөрү тарабынан коддолгон BGCтердин максималдуу санын гана эсептебестен, ошондой эле табигый талапкер өнүмдөрдүн ар кандай түрлөрүнүн жыштыгын түшүндүргөн бул BGCтердин ар түрдүүлүгүн баалоо менен мүнөздөлдүк (сүрөт. 2c жана методдор). )..Бул изилдөөдө биосинтетикалык жактан эң ар түрдүү түрлөр атайын иштелип чыккан бактериялык MAGs менен көрсөтүлгөнүн таптык.Бул бактериялар өстүрүлбөгөн Candidatus Eremiobacterota филумуна таандык, ал бир нече геномдук изилдөөлөрдөн тышкары негизинен изилденбеген бойдон калууда37,38.Белгилей кетчү нерсе, «ча.Eremiobacterota тукуму жер үстүндөгү чөйрөдө гана талданган39 жана BGC менен байытылган бир да мүчөнү камтышы белгилүү эмес.Бул жерде биз бир түрдөгү сегиз MAG реконструкция алдык (нуклеотиддердин окшоштугу > 99%) 23. Ошондуктан биз грек мифологиясында жана экспедицияларында кооз белек болгон нереиддин (деңиз нимфасынын) атынан аталган түрдүн “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii” аталышын сунуштайбыз.'Ka.13-филогенетикалык аннотацияга ылайык, E. malaspinii ырааттуулугунан төмөн мурда белгилүү болгон туугандарына ээ эмес жана ошондуктан биз сунуш кылган жаңы бактериялык үй-бүлөгө таандык "Ca.E. malaspinii” түрү түр катары жана “Ca.Eudormicrobiaceae” расмий аталышы (Кошумча маалымат).Кыскача метагеномдук реконструкция 'Ca.E. malaspinii геномунун долбоору өтө аз киргизүү, узак окуу метагеномдук секвенирлөө жана 75 кб кайталоо менен бирдиктүү 9,63 Мб сызыктуу хромосома катары бир үлгүнү (Методдор) максаттуу чогултуу менен тастыкталган.жалгыз калган бүдөмүк катары.
Бул түрдүн филогенетикалык контекстти түзүү үчүн, биз максаттуу геномду реконструкциялоо аркылуу Тара океанындагы экспедициядан эукариот менен байытылган метагеномикалык үлгүлөрдөн 40 жакын түрдү издедик.Кыскача айтканда, биз метагеномдук окууларды “Ca.E. malaspinii” жана бул үлгүдөгү жумушка кабыл алуунун жогорулашы башка туугандарынын (ыкмаларынын) бар экендигин көрсөтөт деп гипотеза жасады.Натыйжада, биз жаңы аныкталган үй-бүлөнүн (б.а. "Ca. Eudormicrobiaceae") ичиндеги үч тукумдагы беш түрдү чагылдырган 19 MAGдин айкалышы болгон 10 MAG таптык.Кол менен текшерүүдөн жана сапатты көзөмөлдөөдөн кийин (кеңейтилген маалыматтар, 6-сүрөт жана кошумча маалымат), биз “Ca.Eudormicrobiaceae түрлөрү башка "Са" мүчөлөрүнө караганда чоңураак геномдорду (8 Мб) жана бай биосинтетикалык потенциалды (ар бир түргө 14-22 BGC) көрсөтөт.Clade Eremiobacterota (7 BGC чейин) (сүр. 3a–c).
a, Беш 'Cа филогенетикалык позициялары.Eudormicrobiaceae түрлөрү бул изилдөөдө аныкталган деңиз линияларына мүнөздүү BGC байлыгын көрсөттү.Филогенетикалык дарак бардык 'Ca камтыйт.MAG Eremiobacterota жана GTDBде (89-версия) берилген башка филанын мүчөлөрү (кашадагы геномдук сандар) эволюциялык фон (методдор) үчүн колдонулган.Эң сырткы катмарлар үй-бүлөлүк деңгээлдеги классификацияларды («Ca. Eudormicrobiaceae» жана «Ca. Xenobiaceae») жана класс деңгээлиндеги («Ca. Eremiobacteria») билдирет.Бул изилдөөдө сүрөттөлгөн беш түр алфавиттик-сандык коддор жана сунушталган биномдук аталыштар менен берилген (Кошумча маалымат).б, макул.Eudormicrobiaceae түрлөрү жети жалпы BGC ядролорун бөлүшөт.A2 классында BGC жоктугу өкүл MAG толук эместиги менен шартталган (Кошумча таблица 3).BGCs "Ca.Amphithomicrobium» жана «Ca.Amphithomicrobium” (А жана В класстары) көрсөтүлгөн эмес.c, Бардык BGCs коддолгон "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii Тара океандарынан алынган 623 метатранскриптомдо чагылдырылганы аныкталган.Катуу чөйрөлөр активдүү транскрипцияны көрсөтөт.Кызгылт сары тегерекчелер лог2-трансформацияланган бүктөмдөрдүн төмөнкү жана үй чарба генинин экспрессия ылдамдыгынын (ыкмаларынын) жогору жагында белгилейт.г, салыштырмалуу молчулук ийри сызыктары (ыкмалар) 'Ca.Eudormicrobiaceae түрлөрү көпчүлүк океан бассейндеринде жана бүткүл суу тилкесинде (жер бетинен 4000 м кем эмес тереңдикке чейин) кеңири таралган.Бул эсептөөлөрдүн негизинде биз 'Ca.E. malaspinii' деңиздин тереңиндеги пелагикалык дан менен байланышкан жамааттарда прокариоттук клеткалардын 6%ке чейинин түзөт.Эгерде ал берилген тереңдик катмарынын өлчөмүнүн кандайдыр бир бөлүгүндө табылса, биз түрдү ошол жерде бар деп эсептейбиз.IO – Индия океаны, NAO – Түндүк Атлантика, NPO – Түндүк Тынч океан, RS – Кызыл деңиз, SAO – Түштүк Атлантика, SO – Түштүк океан, SPO – Түштүк Тынч океан.
Санын көптүгүн жана таралышын изилдөө.Eudormicrobiaceae, алар, биз тапкандай, көпчүлүк океан бассейндеринде, ошондой эле бүт суу тилкесинде басымдуулук кылат (3d-сүрөт).Жергиликтүү түрдө алар деңиз микробдорунун 6% түзөт, бул аларды глобалдык деңиз микробиомасынын маанилүү бөлүгүн түзөт.Мындан тышкары, биз Ca салыштырмалуу мазмунун таптык.Eudormicrobiaceae түрлөрү жана алардын BGC экспрессия деңгээли эукариоттук байытылган фракцияда эң жогору болгон (сүрөт. 3c жана кеңейтилген маалыматтар, 7-сүрөт), бул бөлүкчөлөр, анын ичинде планктондор менен мүмкүн болгон өз ара аракеттенүүнү көрсөтүп турат.Бул байкоо "Ca" менен кандайдыр бир окшоштукка ээ.Белгилүү жолдор аркылуу цитотоксикалык табигый өнүмдөрдү өндүргөн Eudoremicrobium BGCтери Myxococcus41 сыяктуу метаболиттерди атайын өндүргөн башка жырткычтарга окшош, жырткычтык жүрүм-турумун көрсөтүшү мүмкүн (Кошумча маалымат жана кеңейтилген маалыматтар, 8-сүрөт).ачылышы Ca.Eudormicrobiaceae азыраак жеткиликтүү (терең океан) же эукариоттук эмес, прокариоттук үлгүлөрдөгү бул бактериялар жана алардын күтүлбөгөн BGC ар түрдүүлүгү эмне үчүн табигый тамак-аш изилдөөлөрүнүн контекстинде түшүнүксүз бойдон калууда.
Акыр-аягы, биз жаңы жолдорду, ферменттерди жана табигый өнүмдөрдү ачууда микробиомага негизделген ишибиздин убадасын эксперименталдык түрдө ырастоого аракет кылдык.BGCs ар кандай класстарынын арасында, RiPP жолу жетилген энзимдер тарабынан негизги пептиддин ар кандай пост-трансляциялык модификацияларынан улам бай химиялык жана функционалдык ар түрдүүлүктү коддогону белгилүү.Ошентип, биз эки 'C тандадык.Eudoremicrobium' RiPP BGC'тери (3b жана 4a-e-сүрөттөр) ар кандай белгилүү BGC (\(\bar{d}\)MIBiG жана \(\bar{d}\)RefSeq 0,2ден жогору) негизделген.
a–c, In vitro гетерологиялык экспрессия жана in vitro ферменттик анализдери (\(\бар{d}\)RefSeq = 0.29) терең деңиздеги Ca түрлөрүнө мүнөздүү RiPP биосинтезинин кластери.E. malaspinii' дифосфорацияланган продукцияны чыгарууга алып келди.в, өзгөртүүлөр жогорку чечим (HR) MS / MS (химиялык структурасында б жана у иондору менен көрсөтүлгөн фрагментация) жана NMR (кеңейтилген маалыматтар, 9-сүрөт) менен аныкталган.d, бул фосфорланган пептид сүт эмүүчүлөрдүн нейтрофил эластазасынын төмөнкү микромолярдык ингибициясын көрсөтөт, ал контролдук пептидде жана суусуздандыруучу пептидде (химиялык алып салуудан келип чыккан дегидратация) кездешпейт.эксперимент Окшош жыйынтыгы менен үч жолу кайталады.Мисалы, протеин биосинтезинин экинчи романынын \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) гетерологиялык экспрессиясы 46 аминокислота өзөктүү пептидди өзгөрткөн төрт жетилген ферменттин функциясын түшүндүрөт.Калдыктар HR-MS/MS, изотопторду белгилөө жана ЯМР анализи (Кошумча маалымат) тарабынан болжолдонгон өзгөртүү сайтына ылайык боёлот.Үзгүлтүксүз түстөр өзгөртүү эки калдыктын биринде болгонун көрсөтүп турат.Сүрөт бир ядродогу бардык жетилген ферменттердин активдүүлүгүн көрсөтүү үчүн көп сандаган гетерологиялык түзүлүштөрдүн жыйындысы.ч, магистралдык амид N-метилдөө үчүн NMR маалыматтарынын иллюстрациясы.Толук натыйжалар сүрөттө көрсөтүлгөн.10 кеңейтилген маалыматтар менен.i, MIBiG 2.0 маалымат базасында табылган бардык FkbM домендеринин арасында жетилген FkbM протеиндик кластердик ферменттин филогенетикалык абалы N-метилтрансфераза активдүүлүгү менен бул үй-бүлөнүн ферментин көрсөтөт (Кошумча маалымат).BGCs (a, e), прекурсордук пептиддик структуралар (b, f) жана табигый продуктулардын болжолдуу химиялык структураларынын (c, g) схемалык диаграммалары көрсөтүлгөн.
Биринчи RiPP жолу (\(\бар{d}\)MIBiG = 0,41, \(\бар{d}\)RefSeq = 0,29) деңиздин тереңинде жашаган түрлөрүнөн гана табылган "Ca.E. malaspinii” жана Пептид- прекурсордун коддору (сүр. 4а, б).Бул жетилген ферментте биз лантипептиддик синтазанын дегидратация доменине гомологдук бир функционалдык доменди аныктадык, ал нормалдуу түрдө фосфорланууну жана андан кийин 43түн алынышын катализдейт (Кошумча маалымат).Ошондуктан, биз прекурсордук пептиддин модификациясы ушундай эки баскычтуу суусузданууну камтыйт деп болжолдойбуз.Бирок, тандемдик масс-спектрометрияны (MS/MS) жана ядролук магниттик-резонанстык спектроскопияны (ЯМР) колдонуп, биз полифосфорланган сызыктуу пептидди аныктадык (сүрөт 4c).Күтүлбөгөн болсо да, биз анын акыркы продукт экендигин тастыктаган бир нече далилдерди таптык: эки түрдүү гетерологиялык хост жана in vitro анализдеринде суусуздануу жок, жетилген ферменттин каталитикалык дегидратация сайтында мутацияланган негизги калдыктарды аныктоо.баары "Ca" тарабынан калыбына келтирилген.E. malaspinii геному (кеңейтилген маалыматтар, 9-сүрөт жана кошумча маалымат) жана, акырында, фосфорланган продуктунун биологиялык активдүүлүгү, бирок химиялык синтезделген суусузданган түрү эмес (4d-сүрөт).Чынында эле, биз экологиялык ролу дагы эле ачыкталууга калганына карабастан, концентрация диапазонунда (IC50 = 14,3 мкм) 44 башка байланышкан табигый продуктылар менен салыштырууга болот, нейтрофил эластазага каршы төмөн микромолярдык протеаза ингибитордук иш-аракетин көрсөтөт деп таптык.Мына ушул жыйынтыктарга таянып, биз жолду “фосфептин” деп атоону сунуштайбыз.
Экинчи учур "Ca" үчүн мүнөздүү татаал RiPP жолу.Eudoremicrobium тукуму (\(\бар{d}\)MIBiG = 0,46, \(\бар{d}\)RefSeq = 0,33) табигый белок продуктуларын коддоо үчүн болжолдонгон (сүрөт 4e).Бул жолдор салыштырмалуу кыска BGCs45 менен коддолгон ферменттер тарабынан белгиленген адаттан тыш химиялык модификациялардын күтүлгөн тыгыздыгы жана ар түрдүүлүгү менен өзгөчө биотехнологиялык кызыкчылыкты жаратат.Биз бул белоктун полицерамиддердин негизги NX5N мотиви жана ландорнамиддердин лантионин цикли 46 да жок экендиги менен мурда мүнөздөлгөн белоктордон айырмаланарын таптык.Жалпы гетерологиялык экспрессия үлгүлөрүнүн чектөөлөрүн жеңүү үчүн, биз төрт жетилген жол энзимдерин (ыкмаларын) мүнөздөш үчүн аларды колдонуучу Microvirgula aerodenitrificans системасы менен бирге колдондук.MS / MS, изотопторду белгилөө жана ЯМР айкалышын колдонуп, биз пептиддин 46 аминокислотасынын өзөгүндө бул жетилген ферменттерди таптык (сүрөт. 4f, g, кеңейтилген маалыматтар, 10-12-сүрөттөр жана кошумча маалымат).жетилген энзимдердин арасында, биз RiPP жолунда FkbM O-methyltransferase үй-бүлө мүчөсү 47 биринчи көрүнүшүн мүнөздөгөн жана күтүлбөгөн жерден бул жетилген энзим омуртка N-methylation (сүрөт. 4h, i жана кошумча маалымат) киргизет деп табылган.Бул модификация табигый NRP48 продуктуларында белгилүү болсо да, амиддик байланыштардын ферменттик N-метиляциясы татаал, бирок биотехнологиялык жактан маанилүү реакция49 болуп саналат, ал буга чейин RiPP борозиндеринин үй-бүлөсүн кызыктырган.Өзгөчөлүк 50,51.Ферменттердин башка үй-бүлөлөрүндө жана RiPPде бул активдүүлүктү аныктоо жаңы колдонмолорду ачып, белоктордун 52 функционалдуу ар түрдүүлүгүн жана алардын химиялык ар түрдүүлүгүн кеңейтиши мүмкүн.Белгиленген өзгөртүүлөрдүн жана сунушталган продукт структурасынын адаттан тыш узундугунун негизинде биз “питонамид” аталышын сунуштайбыз.
Ферменттердин функционалдуу түрдө мүнөздөлгөн үй-бүлөсүндө күтүлбөгөн энзимологиянын ачылышы экологиялык геномиканын жаңы ачылыштар үчүн убадасын көрсөтөт, ошондой эле ырааттуулук гомологиясына гана негизделген функционалдык жыйынтык чыгаруу үчүн чектелген мүмкүнчүлүктү көрсөтөт.Ошентип, канондук эмес биоактивдүү polyphosphorylated RiPPs жөнүндө отчеттор менен бирге биздин натыйжалар биохимиялык кошулмалардын функционалдык байлыгын, көп түрдүүлүгүн жана адаттан тыш структураларын толук ачуу үчүн синтетикалык биология аракеттеринин ресурсту көп талап кылган, бирок критикалык маанисин көрсөтөт.
Бул жерде биз микробдор тарабынан коддолгон биосинтетикалык потенциалдын спектрин жана алардын глобалдык деңиз микробиомундагы геномдук контекстти көрсөтүп, натыйжада алынган ресурсту илимий коомчулукка жеткиликтүү кылуу менен келечектеги изилдөөлөрдү жеңилдетет (https://microbiomics.io/ocean/).Биз анын филогенетикалык жана функционалдык жаңылыктарынын көбүн MAGs жана SAGs реконструкциялоо аркылуу гана алууга болорун таптык, айрыкча, келечектеги биоиздөө аракеттерине багыт бере турган аз пайдаланылган микробдук жамааттарда.Биз бул жерде 'Cа'га токтолобуз да."Eudormicrobiaceae" тукуму, өзгөчө биосинтетикалык жактан "таланттуу", ачыла элек микробиотада болжолдонгон көптөгөн BGCs экологиялык жана/же биотехнологиялык жактан маанилүү иш-аракеттери бар кошулмаларды пайда кылган мурда сүрөттөлбөгөн энзимологияларды коддошот.
Океан бассейндериндеги, терең катмарлардагы жана убакыттын өтүшү менен глобалдык деңиз микробдук коомчулугун максималдуу камтуу үчүн жетиштүү секвенирлөө тереңдиги менен негизги океанографиялык жана убакыттык катар изилдөөлөрүнүн метагеномикалык маалымат топтомдору киргизилген.Бул маалымат топтомдору (1-кошумча таблица жана 1-сүрөт) Тара океандарынан чогултулган үлгүлөрдөн алынган метагеномиканы камтыйт (вирустук байытылган, n = 190; прокариоттук байытылган, n = 180) 12,22 жана BioGEOTRACES экспедициясы (n = 480).Гавайи океандык убакыт сериясы (HOT, n = 68), Бермуд-Атлантика убакыт сериясы (BATS, n = 62)21 жана Маласпина экспедициясы (n = 58)23.Бардык метагеномикалык фрагменттерден секвенирлөө окуулары BBMap (v.38.71) аркылуу сапат үчүн чыпкаланган, окуулардан секвенирлөө адаптерлерин алып салуу, сапатты көзөмөлдөө ырааттуулугуна (PhiX геномдору) түшүрүлгөн окууларды алып салуу жана trimq = 14, maq = 20 окуунун сапатынын начардыгын жокко чыгарат, maxns = 0 жана minlength = 45. Кийинки анализдер аткарылды же көрсөтүлгөн болсо, QC окуулары менен бириктирилди (bbmerge.sh minoverlap=16).QC көрсөткүчтөрү метаSPAdes (зарыл болсо v.3.11.1 же v.3.12) менен курууга чейин нормалдаштырылган (bbnorm.sh максат = 40, minddepth = 0)53.Натыйжадагы склад контигдери (мындан ары - склад деп аталат) акыры узундугу (≥1 кб) боюнча чыпкаланган.
1038 метагеномикалык үлгүлөр топторго бөлүнгөн жана үлгүлөрдүн ар бир тобу үчүн бардык үлгүлөрдүн метагеномикалык сапатты көзөмөлдөө көрсөткүчтөрү ар бир үлгүнүн кашааларына өз-өзүнчө дал келген, натыйжада төмөнкү эки катар кашаа тобунун окулушу пайда болгон: Тара деңиз вирустары – байытылган (190×190), Прокариоттор байытылган (180×180), BioGEOTRACEES, HOT жана BATS (610×610) жана Маласпина (58×58).Карталоо Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 аркылуу аткарылган, ал окууларды экинчилик сайттарга дал келтирүүгө мүмкүндүк берет (-a желектин жардамы менен).Тегиздөөлөр кеминде 45 негиздер узундугу, ≥97% окшоштугу жана ≥80% окулушу үчүн чыпкаланган.Натыйжадагы BAM файлдары MetaBAT2 (v.2.12.1)55 үчүн jgi_summarize_bam_contig_depths скрипти аркылуу ар бир топ үчүн үлгү ичиндеги жана аралык камтууну камсыз кылуу үчүн иштетилген.Акыр-аягы, кашаалар сезгичтигин жогорулатуу үчүн топтоштурулган, MetaBAT2 менен –minContig 2000 жана –maxEdges 500 менен бардык үлгүлөрдү жекече иштетүү.жана башка кеңири колдонулган мушкерлерге караганда 10-50 эсе ылдамыраак57.Көпчүлүк корреляциянын таасирин текшерүү үчүн метагеномиканын кокусунан тандалып алынган чакан үлгүсү (Тара Океанынын эки маалымат топтомунун ар бири үчүн 10, BioGEOTRACES үчүн 10, ар бир убакыт сериясы үчүн 5 жана Маласпина үчүн 5) кошумча үлгүлөрдү гана колдонду.Камтуу маалыматын алуу үчүн ички үлгүлөр топтоштурулган.(Кошумча маалымат).
Кошумча (тышкы) геномдор кийинки анализге киргизилген, тактап айтканда Tara Oceans26 маалымат топтомунун чакан топтомунан кол менен тандалган 830 MAG, GORG20 маалымат топтомунан 5287 SAG жана MAR маалымат базасынан (MarDB v. 4) 1707 изоляцияланган REF жана 682 SAGs) 27. MarDB маалыматтар топтому үчүн геномдор жеткиликтүү метаберилиштердин негизинде тандалат, эгерде үлгү түрү төмөнкү кадимки туюнтмага дал келсе: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] изоляцияланган'.
Ар бир метагеномикалык контейнердин жана тышкы геномдун сапаты CheckM (v.1.0.13) жана Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0) 58,59 аркылуу бааланган.Эгерде CheckM же Anvi'o ≥50% толуктук/толук жана ≤10% булгануу/артыкчылыкты билдирсе, кийинчерээк талдоо үчүн метагеномдук клеткаларды жана тышкы геномдорду сактаңыз.Андан кийин бул упайлар геномдун сапатын жамааттык критерийлерге60 ылайык классификациялоо үчүн орточо толуктукка (mcpl) жана орточо булганууга (mctn) кошулду: жогорку сапат: mcpl ≥ 90% жана mctn ≤ 5%;жакшы сапат: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, орточо сапат: mcpl ≥ 50% жана mctn ≤ 10%, адилет сапат: mcpl ≤ 90% же mctn ≥ 10%.Чыпкаланган геномдор сапат упайлары менен (Q жана Q') төмөнкүдөй корреляцияланган: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (штаммдын өзгөрмөлүүлүгү)/100 + 0,5 х log[N50].(dRep61де ишке ашырылган).
Ар кандай маалымат булактарынын жана геномдордун түрлөрүнүн (MAG, SAG жана REF) ортосунда салыштырма талдоо жүргүзүү үчүн, dRep (v.2.5.4) жардамы менен геном боюнча орточо нуклеотиддик иденттүүлүктүн (ANI) негизинде 34 799 геномдун шилтемеси жокко чыгарылган.Кайталанат)61 95% ANI босогосу менен28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) жана SpecI63 колдонуп, түр деңгээлинде геномдун кластерин камсыз кылган бир нускалуу маркер гендер.Ар бир dRep кластери үчүн жогоруда аныкталган сапаттын максималдуу баллына (Q') ылайык репрезентативдик геном тандалды, ал түрдүн өкүлү болуп эсептелинет.
Карта түзүү ылдамдыгын баалоо үчүн, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) OMD камтылган 34,799 геномдор менен метагеномикалык окуулардын бардык 1038 топтомун картага түшүрүү үчүн колдонулган.Сапаты көзөмөлдөнгөн окуулар бир тараптуу режимде картага түшүрүлгөн жана натыйжада түздөөлөр узундугу ≥45 bp гана тегиздөөлөрдү сактап калуу үчүн чыпкаланган.жана идентификация ≥95%.Ар бир үлгү үчүн дисплей катышы - фильтрациядан кийин калган көрсөткүчтөрдүн пайызы сапатты көзөмөлдөө көрсөткүчтөрүнүн жалпы санына бөлүнөт.Ошол эле ыкманы колдонуу менен, 1038 метагеномдун ар бири 5 миллион кыстарууга чейин кыскарган (кеңейтилген маалыматтар, 1c-сүрөт) жана OMD жана бардык GEM16да GORG SAG менен дал келген.GEM16 каталогундагы деңиз суусунан алынган MAG көлөмү деңиз суусунун үлгүлөрүн тандоо менен (мисалы, деңиз чөкмөлөрүнөн айырмаланып) метагеномикалык булактардын ачкыч суроосу менен аныкталган.Тактап айтканда, биз “суу жашоочуларын” “экосистеманын_категориясы”, “деңизди” “экосистеманын_тиби” катары, ал эми “жашоо чөйрөсүн” “терең океан”, “деңиз”, “деңиз океандык”, “пелагиялык деңиз”, “деңиз суулары” катары чыпкалайбыз, «Океан», «Деңиз суусу», «Деңиздин үстүнкү суусу», «Деңиздин үстүнкү суусу».Мунун натыйжасында 5903 MAG (734 жогорку сапат) 1823 OTU (бул жерден көрүлөт).
Прокариоттук геномдор GTDB-Tk (v.1.0.2)64 аркылуу таксономиялык аннотацияланган, демейки параметрлери GTDB r89 13 версиясын көздөгөн. Anvi'o доменди болжолдоо жана кайра чакырып алуу ≥50% жана ашыкча ≤ 10% негизинде эукариоттук геномдорду аныктоо үчүн колдонулган.Түрдүн таксономиялык аннотациясы анын өкүлү геномдорунун бири катары аныкталат.Эукариотторду кошпогондо (148 MAG), ар бир геном алгач прокка (v.1.14.5)65 аркылуу функционалдык аннотацияланган, толук гендердин аталышы, зарылчылыкка жараша “археялар” же “бактериялардын” параметрлерин аныктоо, ал эми башкалар үчүн да билдирилген. коддоочу гендер.жана CRISPR аймактары, башка геномдук өзгөчөлүктөр арасында.fetchMG (v.1.2)66 аркылуу универсалдуу бир копиялуу маркер гендерин (uscMG) аныктоо менен болжолдонгон гендерге аннотация жазыңыз, ортоологиялык топторду дайындаңыз жана eggNOG (v.5.0)68 негизинде emapper (v.2.0.1)67 аркылуу сураңыз.KEGG маалыматтар базасы (2020-жылдын 10-февралында жарыяланган) 69. Акыркы кадам ≥70% суроо жана теманы камтуу менен DIAMOND (v.0.9.30)70 колдонуу менен протеиндерди KEGG маалымат базасына дал келтирүү аркылуу аткарылган.Натыйжалар андан ары NCBI прокариоттук геномунун аннотация түтүкчөсүнө71 ылайык чыпкаланды (шилтеменин өзү).Демейки параметрлери жана ар кандай кластердик жарылуулар менен antiSMASH (v.5.1.0)72 колдонуп геномдогу BGCлерди аныктоо үчүн ген ырааттуулугу да кириш катары колдонулган.Бардык геномдор жана аннотациялар интернетте жеткиликтүү контексттик метаберилиштер менен бирге OMDге түзүлдү (https://microbiomics.io/ocean/).
Мурда сүрөттөлгөн методдорго окшош 12,22 биз CD-HIT (v.4.8.1) OMDден бактериялык жана археалдык геномдордон >56,6 миллион протеин коддоочу гендерди 95% идентификацияга жана кыскараак гендерге (90% камтууга)73 кластерлөө үчүн колдондук. >17,7 миллион ген кластерлери.Ар бир ген кластери үчүн өкүл ген катары эң узун ырааттуулук тандалды.Андан кийин 1038 метагеном > 17,7 миллион BWA (-a) кластер мүчөлөрүнө дал келген жана натыйжада BAM файлдары ≥95% окшоштук жана ≥45 базалык тегиздөөлөр менен гана тегиздөөлөрдү сактоо үчүн чыпкаланган.Узундук нормалдаштырылган гендин көптүгү адегенде эң мыкты уникалдуу тегиздөөнүн кошумчаларын санап, андан кийин бүдөмүк карталанган кыстармалар үчүн, тиешелүү максаттуу гендерге алардын уникалдуу кыстармаларынын санына пропорционалдуу бөлчөк сандарды кошуу менен эсептелген.
Кеңейтилген OMDден геномдор ("Ca. Eudormicrobiaceae"ден кошумча MAGs менен, төмөндө караңыз) mOTUs74 метагеномикалык талдоо куралы базасына (v.2.5.1) кошулган, кеңейтилген mOTU маалымдама базасын түзүү.Он uscMGдин ичинен алты бир нускалуу геном (23 528 геном) гана аман калган.Маалымат базасын кеңейтүү натыйжасында түр деңгээлинде 4494 кошумча кластер түзүлдү.1038 метагеномдор демейки mOTU параметрлерин колдонуу менен талдоого алынган (v.2).644 MOTU кластеринде камтылган жалпы 989 геном (95% REF, 5% SAG жана 99,9% MarDBге таандык) MOTU профили тарабынан аныкталган эмес.Бул MarDB геномдорунун деңиз изоляциясынын ар кандай кошумча булактарын чагылдырат (аныкталбаган геномдордун көбү чөкмөлөрдөн, деңиз қожайындарынан жана башкалардан бөлүнүп алынган организмдер менен байланышкан).Бул изилдөөдө ачык океан чөйрөсүнө көңүл бурууну улантуу үчүн, эгерде алар аныкталбаса же бул изилдөөдө түзүлгөн MOTU кеңейтилген маалымат базасына киргизилбесе, биз аларды ылдыйкы агымдагы анализден чыгардык.
OMDдеги MAG, SAG жана REF'тин бардык BGC'лери (жогоруда караңыз) бардык метагеномикалык складдарда аныкталган BGCs менен бириктирилген (antiSMASH v.5.0, демейки параметрлер) жана BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM домени )75 менен мүнөздөлгөн.Бул өзгөчөлүктөрдүн негизинде, биз BGC ортосундагы бардык косинус аралыктарды эсептеп чыктык жана аларды (орточо шилтемелер) тиешелүүлүгүнө жараша 0,2 жана 0,8 аралык босоголорун колдонуу менен GCF жана GCCге топтодук.Бул босоголор мурун Евклиддик аралык75 менен косинус аралыкты колдонуу менен колдонулган босоголордун адаптациясы болуп саналат, бул BiG-SLICE кластердик баштапкы стратегиясындагы каталардын бир бөлүгүн жеңилдетет (Кошумча маалымат).
BGCs андан кийин мурда сүрөттөлгөндөй фрагментация коркунучун азайтуу үчүн жана 1038 метагеномдордо кездешпеген MarDB REFs жана SAGs (жогоруда караңыз) жок кылуу үчүн скафлекторлордо коддолгон ≥5 кб гана сактоо үчүн чыпкаланган.Мунун натыйжасында жалпысынан 39 055 BGC OMD геному тарабынан коддолгон, кошумча 14 106 метагеномикалык фрагменттерде аныкталган (б.а. MAGs менен бириктирилген эмес).Бул "метогеномикалык" BGCлер маалымат базасында камтылбаган деңиз микробиомунун биосинтез потенциалынын үлүшүн баалоо үчүн колдонулган (Кошумча маалымат).Ар бир BGC функционалдык түрдө анти-SMASH же BiG-SCAPE76да аныкталган одоно продукт категориялары менен аныкталган прогноздук продукт түрлөрүнө ылайык мүнөздөлгөн.Ар бир түр үчүн GCF үчүн эң узун BGC гана сактоо менен (GCC/GCF таксономиялык жана функционалдык курамы, GCF жана GCC шилтеме маалыматтар базасына чейинки аралык жана GCF метагеномикалык көптүгү) сандык аныктоодо үлгүлөрдү алуудан баш тартууга жол бербөө үчүн, 39,055 BGC дагы дедупликацияланган, натыйжада жалпысынан 17,689 BGC.
GCC жана GCF жаңылыгы эсептелген маалымат базасы (BiG-FAMдагы RefSeq маалымат базасы)29 менен эксперименталдык түрдө текшерилген (MIBIG 2.0)30 BGC ортосундагы аралыктын негизинде бааланган.17,689 өкүл BGCдин ар бири үчүн биз тиешелүү маалымат базасына эң кичине косинус аралыкты тандадык.Андан кийин бул минималдуу аралыктар тиешелүүлүгүнө жараша GCF же GCC боюнча орточо (орточо) алынат.Эгерде маалымат базасына чейинки аралык 0,2ден ашса, GCF жаңы деп эсептелет, бул (орточо) GCF менен шилтеменин ортосундагы идеалдуу бөлүнүүгө туура келет.GCC үчүн биз шилтемелер менен узак мөөнөттүү байланышты бекемдөө үчүн GCF тарабынан аныкталган босогодон эки эсе көп болгон 0,4тү тандайбыз.
BGCдин метагеномдук көптүгү ген деңгээлиндеги профилдерден жеткиликтүү анын биосинтетикалык гендеринин (анти-SMASH тарабынан аныкталгандай) орточо көптүгү катары бааланган.Ар бир GCF же GCCдин метагеномдук көптүгү андан кийин өкүл BGCтердин суммасы катары эсептелген (17,689дан).Бул молчулук карталары кийинчерээк ар бир үлгүдөгү mOTU эсебин колдонуу менен уюлдук курамы үчүн нормалдаштырылган, бул да ырааттуулук аракеттерин эсепке алган (кеңейтилген маалыматтар, 1d-сүрөт).GCF же GCC таралышы > 0 болгон үлгүлөрдүн пайызы катары эсептелген.
Үлгүлөрдүн ортосундагы Евклиддик аралык нормалдаштырылган GCF профилинен эсептелген.Бул аралыктар UMAP77 аркылуу өлчөмүн азайтып, натыйжада кыстаруу HDBSCAN78 аркылуу көзөмөлсүз тыгыздыкка негизделген кластерлөө үчүн колдонулган.HDBSCAN колдонгон кластер үчүн упайлардын оптималдуу минималдуу саны (демек, кластерлердин саны) кластерге мүчөлүктүн жыйынды ыктымалдыгын максималдаштыруу жолу менен аныкталат.Аныкталган кластерлер (жана дисперсиянын пермутациялык көп өзгөрмөлүү талдоосунда (PERMANOVA) тенденцияны эсепке алуу үчүн бул кластерлердин кокус тең салмакталган чакан үлгүсү) PERMANOVA аркылуу кыскартылбаган Евклиддик аралыктарга каршы маанилүүлүгү үчүн сыналган.Үлгүлөрдүн геномунун орточо өлчөмү mOTUнун салыштырмалуу көптүгүнө жана геномдордун мүчөлөрүнүн болжолдуу геномунун өлчөмүнө жараша эсептелген.Атап айтканда, ар бир mOTU геномунун орточо өлчөмү толуктугу үчүн коррекцияланган (фильтрлөөдөн кийин) анын мүчөлөрүнүн геномунун орточо өлчөмү катары бааланган (мисалы, узундугу 3 Мб болгон 75% толук геномдун 4 түзөтүлгөн өлчөмү бар) Mb).бүтүндүгү ≥70% менен орто геномдор үчүн.Ар бир үлгү үчүн орточо геном өлчөмү андан кийин салыштырмалуу молчулук менен салмактанып алынган mOTU геномунун өлчөмдөрүнүн суммасы катары эсептелген.
OMDдеги геном менен коддолгон BGCлердин чыпкаланган топтому бактериялык жана археалдык GTDB дарактарында (≥5 кб алкактарда, 1038 метагеномдо кездешпеген REF жана SAG MarDB кошпогондо, жогоруда караңыз) жана алардын филогенетикасынын негизинде болжолдонгон продукт категорияларында көрсөтүлгөн. геномдун абалы (жогоруда кара).Биз алгач ошол түрдөгү эң көп BGC менен геномду өкүл катары колдонуп, маалыматтарды түрлөр боюнча кыскарттык.Визуалдаштыруу үчүн, өкүлдөр андан ары дарак топторуна бөлүндү жана дагы бир жолу, ар бир клеткалык класс үчүн, BGCлердин эң көп санын камтыган геном өкүл катары тандалды.BGC менен байытылган түрлөр (жок дегенде бир геном> 15 BGC менен) андан ары ошол BGCлерде коддолгон продукт түрлөрү үчүн Шеннон Диверситетинин индексин эсептөө аркылуу талдоого алынган.Эгерде бардык болжолдонгон продуктунун түрлөрү бирдей болсо, химиялык гибриддер жана башка татаал БГКлар (анти-SMAH тарабынан алдын ала айтылгандай) кластердеги тартибине карабастан (мисалы, белок-бактериоцин жана бактериоцин-протеопротеиндердин синтези) бир эле продукттун түрүнө таандык деп эсептелет. дене).гибрид).
Malaspina үлгүсүндөгү MP1648 үлгүсүндөгү калган ДНК (болжол менен 6 нг), SAMN05421555 биологиялык үлгүсүнө туура келет жана кыска окуу үчүн Illumina SRR3962772 метагеномикалык окуу топтомуна дал келет, PacBio секвенирлөө протоколуна ылайык иштетилген, PacBio секвенирлөө протоколуна ылайык иштетилген. комплект (100-980-000) жана SMRTbell Express 2.0 шаблон даярдоо комплекти (100-938-900).Кыскача айтканда, калган ДНК Covaris (g-TUBE, 52104) жардамы менен кесилип, оңдолгон жана тазаланган (ProNex мончоктору).Тазаланган ДНК андан соң китепкананы даярдоого, күчөтүүгө, тазалоого (ProNex мончоктору) жана өлчөмүн тандоого (>6 кб, Blue Pippin) акыркы тазалоо кадамына (ProNex мончоктору) жана Sequel II платформасында секвенирлөөдөн өтөт.
Биринчи эки ч.MAG Eremiobacterota үчүн биз алты кошумча ANI > 99% аныктадык (булар 3-сүрөттө камтылган), алар алгач булгануу упайларынын негизинде чыпкаланган (кийин гендердин кайталанышы катары аныкталган, төмөндө караңыз).Биз ошондой эле "Ca" деп жазылган лотокту таптык.Eremiobacterota”23 ар кандай изилдөөлөрдөн алынган жана аларды биздин изилдөөбүздөгү сегиз MAG менен бирге BWA (v.0.7.17) аркылуу 633 эукариоттук байытылган (>0,8 мкм) үлгүлөрдүн метагеномикалык окуулары үчүн шилтеме катары колдонушкан. карта түзүү (5 миллион окуу).Байытууга тиешелүү карталардын негизинде (95% тегиздөө инсандыгы жана 80% окуу камтуусу менен чыпкаланган), 10 метагеномдор (күтүлгөн камтуу ≥5×) жана кошумча 49 метагеномдор (күтүлгөн камтуу ≥1×) мазмундук корреляция үчүн тандалган.Жогорудагыдай эле параметрлерди колдонуу менен, бул үлгүлөр бириктирилип, 10 кошумча "Ca" кошулду.MAG Eremiobacterota калыбына келтирилди.Бул 16 MAG (базадагы экөөнү эсепке албаганда) кеңейтилген OMDдеги геномдордун жалпы санын 34,815ке жеткирет.MAGs алардын геномдук окшоштугуна жана GTDBдагы абалына жараша таксономиялык рангдар ыйгарылат.18 MAG бир эле үй-бүлөнүн ичиндеги 5 түргө (түр ичиндеги ANI > 99%) жана 3 тукумга (интрагенердик ANI 85% дан 94%) dRep аркылуу репликацияланган79.Түрлөрдүн өкүлдөрү кол менен бүтүндүгү, булгануусу жана N50 негизинде тандалып алынган.Сунушталган номенклатура Кошумча маалыматта келтирилген.
'Cа бүтүндүгүн жана булганышын баалоо.MAG Eremiobacterota, биз uscMG, ошондой эле CheckM жана Anvi'o тарабынан колдонулган линия жана доменге тиешелүү бир нускалуу маркер ген топтомдорунун бар экендигин бааладык.40 uscMGs ичинен 2 дубликатынын идентификациясы ар кандай потенциалдуу булганууну жокко чыгаруу үчүн филогенетикалык реконструкциялоо менен тастыкталды (төмөндө караңыз).Беш өкүлү MAGs кошумча изилдөө 'Ca.Бул реконструкцияланган геномдордогу булгоочу заттардын төмөн деңгээли Eremiobacterota түрлөрү үчүн молчулуктун жана ырааттуулуктун курамынын корреляциясынын негизинде интерактивдүү Anvi'o интерфейсин колдонуу менен тастыкталды (Кошумча маалымат)59.
Филогеномикалык талдоо үчүн биз беш өкүлү MAG "Ca" тандап алган.Eudormicrobiaceae», бардык түрлөрү «Ca.Eremiobacterota геному жана башка филанын мүчөлөрү (анын ичинде UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria жана Planctomycetota) GTDB (r89)13 жеткиликтүү.Бул геномдордун баары мурда бир көчүрмөсү маркер ген чыгаруу жана BGC аннотация үчүн сүрөттөлгөн аннотацияланган.GTDB геномдору жогоруда көрсөтүлгөн бүтүндүк жана булгануу критерийлерине ылайык сакталган.Филогенетикалык талдоо Anvi'o Phylogenetics59 иш агымы аркылуу жүргүзүлдү.Дарак IQTREE (v.2.0.3) (демейки параметрлер жана -bb 1000)80 аркылуу Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81 тарабынан аныкталган 39 тандемдик рибосомалык протеиндердин түзүлүшү боюнча курулган.Анын кызматтары кыскартылды.геномдун жок дегенде 50% камтуу үчүн82 жана Planctomycecota GTDB дарак топологиясынын негизинде сырткы топ катары колдонулган.40 uscMGs бир дарак ошол эле аспаптар жана параметрлерди колдонуу менен курулган.
Биз Traitar (v.1.1.2) демейки параметрлери (фенотип, нуклеотиддерден)83 жалпы микроб белгилерин болжолдоо үчүн колдондук.Биз геномдогу протеинди коддоочу гендин мазмунуна көз каранды, мурда иштелип чыккан жырткычтык индекс84 негизинде потенциалдуу жырткыч жашоо образын изилдедик.Тактап айтканда, биз DIAMOND менен геномдогу протеиндерди OrthoMCL маалымат базасына (v.4)85 салыштыруу үчүн колдонобуз – көбүрөөк сезгич – ID 25 – суроо-копку 70 – субьект-капкагы 70 – топ 20 ЖАНА генге туура келген гендерди санайбыз. жырткычтар жана жырткыч эместер үчүн маркер гендер.Индекс жырткыч жана жырткыч эмес белгилердин санынын ортосундагы айырма.Кошумча көзөмөл катары биз "Са" геномун да талдадык.Entotheonella TSY118 фактору анын Ca менен байланышына негизделген.Eudoremicrobium (ири геном өлчөмү жана биосинтетикалык потенциал).Андан кийин, биз жырткыч жана жырткыч эмес маркер гендердин ортосундагы потенциалдуу байланыштарды жана Ca биосинтетикалык потенциалын сынап көрдүк.Eudormicrobiaceae» жана бирден ашык ген (маркердик гендин ар кандай түрүнөн, б.а. жырткыч/жырткыч эмес ген) BGC менен бири-бирине дал келбей турганын аныктады, бул BGC жырткычтык сигналдарын адаштырбайт дегенди билдирет.Шифрленген репликондордун кошумча геномдук аннотациясы TXSSCAN (v.1.0.2) аркылуу секреция системасын, пили жана флагелланы86 атайын текшерүү үчүн аткарылган.
Тара океандарынын прокариоттук жана эукариоттук байытуу фракцияларынан 623 метатранскриптомдорду картага түшүрүү аркылуу беш өкүлү 'Ca картасы тартылган22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a желектин жардамы менен).Eudormicrobiaceae геному.BAM файлдары FeatureCounts (v.2.0.1)88 менен 80% окуу камтылышы жана 95% идентификациялык чыпкалоо менен иштетилди (параметрлери менен FeatureCounts –биринчи -O –фракция -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) бир генге киргизүүлөрдүн саны.Түзүлгөн карталар гендин узундугу жана маркер генинин көптүгү mOTU үчүн нормалдаштырылган (киргизилген саны >0 болгон гендер үчүн узундук боюнча нормалдаштырылган орточо киргизүү саны) жана ар бир ген деңгээлиндеги клеткага салыштырмалуу экспрессияны алуу үчүн лог-22,74кө өзгөртүлгөн, бул дагы түшүндүрөт секвенирлөө учурунда үлгүдөн үлгүгө өзгөрмөлүүлүк.Мындай катыштар салыштырмалуу көп маалыматтарды колдонууда курамы көйгөйлөрүн жумшартып, салыштырмалуу талдоо жүргүзүүгө мүмкүндүк берет.Геномдун жетишерлик чоң бөлүгүн аныктоого мүмкүндүк берүү үчүн андан аркы талдоо үчүн 10 mOTU маркер генинин >5и бар үлгүлөр гана каралды.
'Ca нормалдаштырылган транскриптомдук профили.E. taraoceanii UMAP аркылуу өлчөмдүүлүктү кыскартууга дуушар болгон жана натыйжадагы өкүлчүлүк туюнтма статусун аныктоо үчүн HDBSCAN (жогоруну караңыз) аркылуу көзөмөлсүз кластерлөө үчүн колдонулган.PERMANOVA баштапкы (кичирейген эмес) аралык мейкиндигинде аныкталган кластерлердин ортосундагы айырмачылыктардын маанисин сынайт.Бул шарттардын ортосундагы дифференциалдык экспрессия геном боюнча сыналган (жогоруда караңыз) жана 201 KEGG жолдору 6 функционалдык топтордо аныкталган, атап айтканда: BGC, секреция системасы жана TXSSCANдан флагеллярдык гендер, деградация ферменттери (протеаза жана пептидазалар), жырткыч жана жырткыч эмес. жырткыч гендер.жырткычтык көрсөткүч маркерлер.Ар бир үлгү үчүн биз ар бир класс үчүн медианалык нормалдаштырылган туюнтманы эсептеп чыктык (BGC экспрессиясынын өзү ошол BGC үчүн биосинтетикалык гендердин медианалык экспрессиясы катары эсептелинерин эске алыңыз) жана мамлекеттер боюнча маанилүүлүгү үчүн сыналган (FDR үчүн туураланган Крускал-Уоллис тести).
Синтетикалык гендер GenScriptтен, ал эми ПТР праймерлери Microsynthтен сатылып алынган.ДНКны күчөтүү үчүн Thermo Fisher Scientific фирмасынын фузион полимеразасы колдонулган.ДНКны тазалоо үчүн NucleoSpin плазмиддери, NucleoSpin гели жана Мачери-Нагелден алынган ПТР тазалоочу комплект колдонулган.Чектөө ферменттери жана Т4 ДНК лигазасы New England Biolabs компаниясынан сатылып алынган.Изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозидден (IPTG) (Биосинт) жана 1,4-дитиотреитолдон (DTT, AppliChem) башка химиялык заттар Sigma-Oldrichтен сатылып алынган жана андан ары тазалоосуз колдонулган.Левомицетин (Cm), спектиномицин дигидрохлориди (Sm), ампициллин (Amp), гентамицин (Gt) жана карбенициллин (Cbn) антибиотиктери AppliChem компаниясынан сатылып алынган.Bacto Tryptone жана Bacto Yeast Extract медиа компоненттери BD Biosciences компаниясынан сатылып алынган.Трипсин секвенирлөө үчүн Promegaдан сатылып алынган.
Ген тизмектери анти-SMASH болжолдонгон BGC 75.1ден алынган.E. malaspinii (Кошумча маалымат).
embA гендери (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) жана embAM (анын ичинде гендер аралык аймактары) синхрондуу жана синхрондуу түзүлүшү жок PUCR5 менен оптималдаштырылган. E менен туюнтулган d качан.embA гени BamHI жана HindIII бөлүү сайттары менен pACYCDuet-1(CmR) жана pCDFDuet-1(SmR) биринчи көп клондоо сайтына (MCS1) субклондолгон.embM жана embMopt гендери (кодон оптималдаштырылган) MCS1 pCDFDuet-1(SmR) ичине BamHI жана HindIII менен субклондолгон жана pCDFDuet-1(SmR) жана pRSFDuet-1(KanR) (MCS2) менен экинчи көп клондоо сайтына жайгаштырылган. NdeI/ChoI.embAM кассетасы BamHI жана HindIII бөлүү сайттары менен pCDFDuet1(SmR) ичине субклондолгон.orf3/embI гени (локус, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) EmbI_OE_F_NdeI жана EmbI_OE_R_XhoI праймерлеринин жардамы менен ПТРдин кабатталган кеңейтүүсү аркылуу курулган, NdeI/XhoMCC менен сиңирилген жана ошол эле p1DF1SEmb менен сиңирилген. чектөө ферменттери (кошумча стол).6).Чектөө ферменттерин сиңирүү жана байлатуу өндүрүүчүнүн протоколуна (New England Biolabs) ылайык аткарылган.