310 10*1мм Дат баспас болоттон жасалган ширетилген түтүктүн химиялык компоненти, Спидроиндин N-терминалдык домендери амилоид фибрилдеринин негизиндеги гидрогелдерди түзөт жана белоктун иммобилизациясы үчүн платформаны камсыз кылат.

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Ар бир слайдда үч макала көрсөтүлгөн слайдерлер.Слайддар аркылуу өтүү үчүн артка жана кийинки баскычтарды же ар бир слайд аркылуу жылуу үчүн аягындагы слайд контроллер баскычтарын колдонуңуз.

Спецификация

310 10 * 1mm Дат баспас болоттон жасалган бурмаланган түтүк берүүчүлөр

Химиялык курамы

Механикалык касиеттери

Рекомбинантты жөргөмүш жибек протеиндери (жөргөмүш жибек белоктору) жаңы биоматериалдарды иштеп чыгууда көптөгөн потенциалдуу колдонмолорго ээ, бирок алардын мультимодалдык жана агрегацияга жакын мүнөзү аларды алууну кыйындатат жана колдонууга оңой.Бул жерде биз рекомбинанттык миниатюралык спидроин протеиндери жана эң негизгиси, N-терминалдык домендин (NT) өзү 37 °C температурада өзүн-өзү колдой турган жана тунук гидрогелдерди тез түзөөрүн кабарлайбыз.NT жана жашыл флуоресценттик протеинден же пуриндик нуклеозид фосфорилазадан турган синтез белоктору толук функционалдык синтез белокторун түзөт.Гидрогельдер.Биздин натыйжалар рекомбинантты NT жана синтез протеиндери жогорку экспрессия түшүмдүүлүгүн камсыз кылып, гидрогельдерге ачыктык, кайчылаш байланышсыз гелация жана жогорку тыгыздыкта активдүү протеиндердин түз иммобилизациясы сыяктуу жагымдуу касиеттерге ээ экенин көрсөтүп турат.
Жөргөмүштөрдүн ар бири жибектин белгилүү бир түрүн чыгарган жети түрдүү жибек бездери бар.Жибектин бардык жети түрү жөргөмүш жибек белокторунан (спидроиндер) болжол менен 6000 калдыктардан турат жана тоголок N- жана С-терминал домендери (NT жана CT) менен курчалган чоң борбордук кайталануучу аймакты камтыйт1,2.Жибектин эң көп изилденген түрү, биринчилик ампула, негизги ампула бези тарабынан өндүрүлөт.Бул безде эпителий клеткаларынын бир катмары спидроин белокторун синтездеп, аларды бездин люменине бөлүп чыгарат, анда алар эрүүчү формада (допинг) өтө жогорку концентрацияда (30–50% с/к) болот3,4.Бездеги негизги ампулярдык спидроин белокторунун уюштуруусу жана конформациясы талкууланган, бирок көпчүлүк эксперименталдык далилдер жалпысынан спиральдуу жана/же кокус спиралдык конформациянын жана мицеллярдык же ламеллярдык структуралардын бар экендигин көрсөтүп турат5,6,7,8,9,10.Кайталануучу домендер жибек жипчелеринин механикалык касиеттерин жөнгө салса, β-баракча нанокристаллдарын жана аморфтук структураларды түзүшөт11,12,13,14,15, акыркы домендер жибек безинин 16,17,18 боюндагы өзгөрүп жаткан шарттарга жооп кылып жибек жипчелерин жөнгө салат.Жибектин пайда болушун көзөмөлдөө менен, 19. Терминалдык домендер эволюциялык жактан сакталат жана алардын функциясы бардык спидроин белокторуна жалпы болушу мүмкүн 2,20,21.Безден өтүү учурунда спидроиндин рНы болжол менен 7,6дан <5,716га чейин төмөндөйт жана акырындык менен кууш түтүк аркылуу кыймылдын аркасында кесүү жана созуу менен жогорулайт.Эритмеде CT α-спиральдуу түзүүчү параллелдүү dimer17, бирок төмөн рН жана жылма күчтөргө жооп катары, CT ачылып, β-катмарларын16, 17 которуштуруусу мүмкүн, Convert 16нын кайталануучу аймактарында β-кабаттарды козгойт. NT астында мономердик болуп саналат. бездин люмениндеги шарттарды чагылдырган шарттар жана спидроиндин эригичтигине ортомчулук кылат, бирок рН төмөндөтүлгөндө, бир катар карбон кислотасынын каптал чынжырларынын протондалышы болжол менен 6,5 pKa менен НТ димеризациясына алып келет, ошону менен НТ стабилдештирилет жана чоң өлчөмдө спидроин фиксацияланат. өлчөмдөрү.тармактар16,18.Ошентип, NT була23,24,25 бир димер каптоо бир мономер өзгөрүп, жип пайда негизги ролду ойнойт.NT гетерологиялык белокторду өндүрүү үчүн эригичтигин жогорулатуучу энбелги катары анын өнүгүшүнө дем берген, бүгүнкү күнгө чейин изилденген бардык шарттарда жогорку эрүүчү жана спираль бойдон калууда.
Бир NT, бир кыска кайталануучу аймак, бир КТ жана тазалоо үчүн His6 тегинен (His-NT2RepCT) турган рекомбинантты мини жөргөмүш жибек протеин суудагы буферде жергиликтүү жөргөмүш жибек протеининдей эрийт жана жибек жөргөмүштүн жергиликтүү маанилүү мүнөздөмөлөрүн туурайт. .камтуу 25.31.His-NT2RepCT рН 8 ээрүүчү каптоо рН 525,32,33,34,35 суу мончосуна экструдцияланган биомиметикалык машинанын жардамы менен үзгүлтүксүз жипчелерге айланса болот.His-NT2RepCT туюндурган E. coli биореакторунун ферментациясы жана андан кийинки дарылоо тазалангандан кийин >14 г/л кирешеге алып келди.Жогорку түшүмдүүлүк, жогорку эригичтиги жана His-NT2RepCTтин кислоталык шарттарга адекваттуу реакциясы NT23, 25, 34 менен байланыштуу.
Бул жерде биз рекомбинантты спидроин белокторунан тунук гидрогелдердин тез пайда болушун, анын ичинде жалгыз NT, 37 °Cде протеин эритмесин инкубациялоо аркылуу билдиребиз.Тиофлавин Т флуоресценциясын (ThT), Фурье трансформациялоо инфракызыл спектроскопиясын (FTIR), ядролук магниттик-резонанстык спектроскопияны (ЯМР) жана өткөрүүчү электрондук микроскопияны (TEM) колдонуп, биз NT жана микро жөргөмүш белоктору β-баракчаларга жана амилоид сымал фибрилдерге структуралык трансформацияга дуушар болорун таптык. гелдер пайда болгондо.Кошумчалай кетсек, NT жана жашыл флуоресценттик протеиндин (GFP) же пуриндик нуклеозид фосфорилазанын (PNP) синтез протеиндери толук функционалдык синтез фрагменттери бар гидрогельдерди түзөт.Физиологиялык шарттарда гидрогелдердин тез пайда болушу менен бирдикте гетерологдук ээлерде жогорку өндүрүмдүүлүктү экспрессиялоо инженердик функциялары бар гидрогелдерди үнөмдүү өндүрүү мүмкүнчүлүгүн ачат.
Көптөгөн рекомбинанттык спидроин белокторунан36 айырмаланып, His-NT2RepCT рН 8де Tris-HCl буферинде туруктуу жана жаан-чачынсыз 500 мг/млге чейин топтолушу мүмкүн25.Ошондуктан, бул протеин 37°С температурада инкубацияланганда оптикалык тунук, өзүн-өзү колдой турган гидрогелдерди тез пайда кылганы бизди таң калтырды (сүрөт 1b-d).Андан аркы изилдөөлөр анын-NT2RepCT гелациясы протеин концентрациясынын кеңири диапазонунда (10–300 мг/мл) болгонун жана бул концентрация гелация убактысы менен тескери корреляцияланганын көрсөттү (сүрөт 1c жана кошумча 1-сүрөт).His-NT2RepCTтин кайсы бөлүктөрү гидрогелдин пайда болушуна ортомчу экенин билүү үчүн, биз ар бир доменди өз-өзүнчө жана колбанын инверсиялык анализин колдонуп, ар кандай комбинацияларда карадык (сүрөт 1a, b).Рекомбинантты спидроиндин бардык сыналган фракциялары чөккөн 2Repди кошпогондо, 1 саатка жетпеген убакытта гелдерди (300 мг/мл белок концентрациясында) түзүштү (сүрөт 1б).Бул NT жана КТ жалгыз айкалышы же кайталануу менен байланышкан, 37°Cде гель түзө аларын жана His6 теги бул процесске кандайдыр бир деңгээлде таасир этпей турганын көрсөтүп турат.NT абдан эрүүчү жана туруктуу протеин жана рекомбинантты спидроин гидрогелдеринин мурунку отчеттору кайталануучу аймактардагы жана/же КТлардагы конформациялык өзгөрүүлөргө гелациялык эффекттерди берген деген жалпы түшүнүктү эске алганда, NT өзү мүмкүн.Гелациянын ачылышы күтүүсүз болду.Кошумча таблица 1) 37, 38, 39. Кызыктуусу, NT ≥ 300 мг/мл концентрацияда 10 мүнөттүн ичинде гелиленип кеткен (сүрөт 1c).NT ар кандай концентрациялары менен флакон инверсия эксперименттери >50 мг/мл NT эритмеси тиешелүү концентрацияда His-NT2RepCTге караганда тезирээк гелдешин көрсөттү (w/v, Figure 1c).
Бул иште изилденген ар кандай спидроин конструкцияларынын схемалык көрүнүшү.b Ар кандай рекомбинантты спидроин белоктору үчүн 37 °C гел убактысы (300 мг/мл) флаконду тескерилөө аркылуу текшерилген.КТ гели дароо инкубациясыз (<300 мг/мл), 2Rep чөкмөлөрү (300 мг/мл, 5 мм шкала).c His-NT2RepCT жана NT гел убактысы 37 ° C боюнча көрсөтүлгөн белок концентрациясында.d His-NT2RepCT жана NT гидрогелдеринин жөргөмүш жана астында басылган "NT" тамгасы бар сүрөттөрү (экөө тең 200 мг/мл, шкала тилкеси 5 мм).
Ар кандай рекомбинантты спидроин белокторунан түзүлгөн гидрогельдер бир аз башкача түскө ээ жана жылаңач көз менен байкоо ар кандай ачык-айкындыкты көрсөтөт (сүрөт 1б).NT гелдери өзгөчө тунук, ал эми башка гелдер тунук эмес болуп калат.Цилиндрдик түтүктөргө куюлган His-NT2RepCT жана NT гелдерин калыптан бүтүн бойдон алып салууга болот (1d-сүрөт).
Табигый жөргөмүш жибек каптамалары рекомбинантты спидроин белокторунун гелациясына алып келери аныкталган шарттарда гел экенин текшерүү үчүн швед көпүрөсүнүн (Larinioides sclopetarius) чоң ампула безинен каптамалар чогултулган.Каптамалар 20 мМ Tris-HCl буферинде 50 мг/мл (өлчөнгөн кургак салмактын негизинде) сакталган, бирок 37 °C температурада 21 күндүк инкубациялоодо гелация байкалган эмес (Кошумча сүрөт 2a).
Бул гелдердин санын аныктоо үчүн, реологиялык өлчөөлөр гелдөө процессин изилдөө жана жалпы механикалык касиеттерин аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн.Атап айтканда, жогорку температурада сактоо модулун (ийкемдүүлүктү) көзөмөлдөө гелдөө температурасы, ошондой эле жабуунун илешкектүү касиеттери жөнүндө маалымат бере алат.Температураны жогорулатуу боюнча эксперименттер (25-45°Cде 1°C/мин колдонуу, табигый жибек запас эритмелерин колдонуу менен мурунку изилдөөлөрдүн негизинде)40,41 His-NT2RepCT жана NT эритмелерин сактоо модулдары температуранын өсүшү менен көбөйгөнүн көрсөттү.көбөйтүлгөн (2-сүрөт жана кошумча 3-сүрөт).Белгилей кетчү нерсе, NT модулу His-NT2RepCTге салыштырмалуу төмөн температурада өсө баштады, бул NT 37°Cде His-NT2RepCT менен түздөн-түз инкубацияланганда байкалган гелдин ылдамыраак убактысына ылайык келет (1-сүрөт).Температуранын кийинки төмөндөшүнөн кийин сактоо модулу төмөнкү маанилерге кайтып келген жок жана жоготуу модулунан жогору бойдон калууда (Кошумча 3-сүрөттү караңыз), бул термикалык жактан кайтарылгыс туруктуу гелацияны көрсөтөт.Желдөөдөн кийин акыркы ийкемдүү модулу His-NT2RepCT гидрогелдери үчүн 100–500 мг/мл концентрациясында 15тен 330 кПага чейин, ал эми NT гидрогелдери үчүн (100–500 мг/мл) акыркы ийкемдүү модулу 2ден 1400гө чейин өзгөрдү. кПа (сүрөт, 2 жана толук рампа маалыматтары) Кошумча 3-сүрөттү караңыз).
a His-NT2RepCT (300 мг/мл) жана b NT (300 мг/мл) титиреп өлчөө учурунда температуранын өзгөрүшү.Жебелер температуранын тенденциясын көрсөтөт, ал эми сактоо модулунун маалыматтарынын жеңилирээк көлөкөлөрү аспап үчүн өндүрүүчү белгилегенден азыраак моменттик маанилерде сыноону сүрөттөйт, бул ызы-чуунун күчөшүнүн себеби болуп саналат.c Жогорку температурадан (100, 300 жана 500 мг/мл) кийин His-NT2RepCT жана NT акыркы модулунун топтолушу.Бардык модулдук көрсөткүчтөр 0,1 Гц жыштыкта ​​алынат.
Желдөө менен байланышкан конформациялык өзгөрүүлөрдү изилдөөнүн потенциалдуу ыкмасы катары, биз His-NT2RepCT жана NT FTIR спектрлерин 37°Cде гелацияга чейин жана кийин жаздык (сүрөт 3a, b).Күтүлгөндөй, His-NT2RepCT жана NT эритмелеринин спектрлери 1645 см-1 тилкеси менен α-спираль/кокус спиралдын экинчилик структурасын көрсөткөн белокторго туура келди.Эки гидрогель үчүн гелация 1617 см-1 жана 1695 см-1 боюнча орто I тилкесинде эки колдун пайда болушуна алып келди (сүрөт 3а, б), бул антипараллель β-баракча структураларынын пайда болгонун көрсөтүп турат.Бул өзгөрүүлөрдү тиешелүү экинчи туунду жана айырма гелация спектрлеринде да ачык көрүүгө болот (Кошумча 4б-сүрөт).NT β-кабатынын эки тилкеси His-NT2RepCTге караганда айкыныраак болгон, бул NT гидрогелиндеги β-катмар тилкелеринин жалпы мазмуну NT2RepCT гидрогелине караганда жогору экенин көрсөтүп турат.
His-NT2RepCT жана b NT (экөө тең 500 мг/мл) FTIR сиңирүү спектри (эритмеге) жана 37°Cде инкубациялоодон кийин (гель).с TEM сүрөттөрү resuspended 50 мг / мл NT2RepCT гелдер жана d NT.Масштаб тилкеси 200 нм.e His-NT2RepCT жана NT гидрогелдеринин була диаметрлери.n = 100 өлчөнгөн фибрилдер, б <0,0001.Ката тилкелери стандарттык четтөөнү көрсөтөт.Ката тилкелеринин борбору орточо болуп саналат.Статистикалык талдоо үчүн жупташтырылбаган t-тест (эки куйруктуу) колдонулган.f ThT ар кандай рекомбинанттык спидроин белокторунун флуоресценциясы (100 мг/мл) 37 °Cде чайкабастан.g NT (100 мг/мл) 0%, 5%, 10% жана 20% уруктар менен 100 мг/мл NT гелден эмдөө эксперименттери.
Трансмиссиялык электрондук микроскопиянын (TEM) жардамы менен гелдин анализи гидрогель амилоид сымал фибрилдерден тураарын көрсөттү (сүрөт 3c, 3d).NT-түзүлгөн фибрилдер узун (диаметри 5-12 нм) жана бутактуу эмес, ал эми His-NT2RepCT фибрилдери узунураак жана диаметри кыйла кененирээк (7-16 нм) болгон (сүрөт 3e).Бул натыйжалар фиброздун кинетикасын thioflavin T (ThT) анализин колдонууга мүмкүндүк берди.Бардык рекомбинантты спидроин белоктору үчүн флуоресценттик сигнал үлгүлөр 37 °Cде инкубацияланганда көбөйгөн (сүрөт 3f, кошумча сүрөт 5a).Бул табылгага ылайык, гелдешүү шарттарында NT жана His-NT2RepCT микроскопиялык изилдөө ThT-позитивдүү агрегаттардын байкаларлык жергиликтүү топтолушу жок ThT флуоресценциясынын бирдей жогорулашын аныктады (Кошумча сүрөт 5b,c).ThT-оң фибрилдердин пайда болушу NT жана His-NTCT булганышынын көбөйүшү менен коштолгон эмес (Кошумча фибрилдер 5d), бул гелдеги фибрилдердин тармагы гелдин ачыктыгын бузбастан пайда болушу мүмкүн дегенди билдирет.Алдын ала түзүлгөн фибрилдерди аз өлчөмдө кошуу менен үрөн себүү кээ бир амилоиддердин фибрилдердин түзүлүшүн кыйла тездетиши мүмкүн42,43,44, бирок NT гидрокоагулянттарынын эритмесине 5%, 10% же 20% (сал./w) NT кошуу.себүү эффекти (сүр. 3g).Балким, бул гидрогелдеги фибрилдердин салыштырмалуу бекем болуп, урук катары колдонулушу мүмкүн эместигинен уламдыр.
Рекомбинантты спидроин белокторунун жогорку температурадагы күтүүсүз жүрүм-туруму гелдин пайда болушуна байланыштуу конформациялык өзгөрүүлөрдү аныктоо үчүн андан ары ядролук магниттик-резонанстык (ЯМР) спектроскопиялык изилдөөлөрдү жүргүзүүгө түрткү берди.Убакыттын өтүшү менен 37°Cде жазылган His-NT2RepCT эритмелеринин ЯМР спектрлери CT дагы эле жарым-жартылай бүктөлгөндүгүн, ал эми NT жана 2Rep сигналдары жок болгонун көрсөттү (сүр. 4a), бул негизинен NT жана 2Rep экенин көрсөтүп, His- NT2RepCT гидрогели.КТ сигналы ошондой эле баштапкы интенсивдүүлүгүнүн 20% га чейин төмөндөтүлгөн, бул КТ да негизинен туруктуу жана гидрогелдин структурасына киргизилгенин билдирет.Алдын ала инкубацияланган үлгүдөгүдөй мобилдүү жана ошону менен ЯМР эритмеси менен байкалган КТнын азыраак бөлүгү үчүн спектрлерде His-NT2Rep тиркелген бөлүгүн иммобилизациялоо кыйын болгондуктан, алгачкы 10 структураланган калдыктар үчүн сигналдар жок.Гидрогелдердин -NT2RepCT абалынын ЯМР спектрлери α-спиралдардын жана β-кабаттардын басымдуу болушун жана азыраак даражада кокустук катушканын конформациясын аныктады (4б-сүрөт).NTде гана болгон метионин калдыктарынын химиялык жылыш анализи бул домен β-баракча структурасына айланганын көрсөттү.Эритмедеги НТтын убакытка көз каранды спектрлери сигналдын интенсивдүүлүгүнүн бирдей төмөндөшүн көрсөттү (4c-сүрөт), ал эми NT гидрогелдеринин катуу абалындагы ЯМР NT калдыктарынын көбү β-баракча структураларына айланганын көрсөттү (4d-сүрөт).2Rep конформациясын анын топтолуу тенденциясына байланыштуу өзүнчө аныктоо мүмкүн эмес.Бирок, NTCT жана His-NT2RepCT гидрогелдеринин катуу абалындагы ЯМР спектрлери абдан окшош болуп көрүндү (сүрөт 4b; Кошумча сүрөт 6b), бул 2Rep His-NT2RepCT гидрогелинин структуралык бөлүгүнө аз салым кошконун билдирет.CT гидрогелдери үчүн α-спиралдары, β-баракчалары жана кокусунан спиральдуу экинчи структуралар бар экени аныкталган (Кошумча сүрөт 6d).Бул КТнын кээ бир бөлүктөрү α-спираль бойдон калууда, ал эми башкалары β-баракчаларга айланаарын көрсөтүп турат.Ошентип, ЯМР спектроскопиясынын натыйжалары NT гидрогелдин пайда болушу үчүн маанилүү экенин жана ошондой эле 2Rep жана CT менен бириккенде β-баракча конформацияга айланганын көрсөтүп турат.Ушуга ылайык, биз жакында эле амилоиддик мейкиндик сыдырмалары NT доменинин бардык беш спиралында пайда болоорун аныктадык жана Waltz алгоритми 1-спиральда амилоидогендик аймакты алдын ала айткан (сүрөт 4e).
15N-HSQC 10 мг/мл His-NT2RepCT эритмесинин 2D спектри (көк) жана инкубациядан кийин 19 сааттан кийин (кызыл) 37°C.Кызыл спектрдеги жеке кайчылаш чокулар жана көк спектрдеги F24, G136, polyA бир тамга аминокислота символдору жана калдык сандары менен белгиленет.Кыстармалар NT, 2Rep жана CT домендеринен тандалган калдыктар үчүн сигналдын интенсивдүүлүгүнүн убакыттан көз карандылыгын көрсөтөт.b His-NT2RepCT гидрогелдеринин катуу абалдагы радиожыштык (RFDR) спектрлери.RFDR спектрлеринде байкалган Cα/Cβ калдыктарынын корреляциясы моделдин пептиддик химиялык жылыштары жана статистикадан алынган баалуулуктар менен салыштыруу жолу менен аныкталды82,83 жана алардын экинчилик структуралары.SSB – айлануучу каптал тилкеси.c 15N-HSQC 10 мг/мл NT эритмесинин бир өлчөмдүү спектрлери 37 °C 36 саат бою инкубациялоодо.Кыстарма убакытка карата көлөмдүү интенсивдүүлүктү көрсөтөт.г NT гидрогелдеринин катуу абалындагы RFDR спектрлери.RFDR спектрлеринде байкалган Cα/Cβ калдыктарынын жана алардын экинчилик структураларынын корреляциялары көрсөтүлгөн.e Zipper маалымат базасынан (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT45.79 фибрилляциялык ык профилинин негизинде.Гексапептиддин мейкиндик чагылган жылышуу терезесинин Розетта энергиясы ккал/моль менен көрсөтүлгөн.Кызыл тилкелер фиброзго жакындыгы жогору гексапептиддерди билдирет (Розетта энергиясы -23 ккал/мольден төмөн; чекиттүү сызыктан төмөн).Жашыл тилкелер Rosetta энергиясы босогодон жогору болгон фрагменттерди көрсөтүп турат, ошондуктан стерикалык сыдырмаларды пайда кылуу ыктымалдыгы аз.Пролинди камтыган фрагменттер анализден чыгарылды (тилкелерсиз).Чарчы бурчтар Waltz алгоритми81 (https://waltz.switchlab.org) тарабынан болжолдонгон амилоидоздун аймактарын көрсөтөт.NT аминокислота калдыктарынын ырааттуулугу жогоруда, ал эми β экинчилик структурасында табылган калдыктардын түрлөрү (катуу абалдагы ЯМР спектроскопиясы менен аныкталат) кызыл түстө көрсөтүлгөн.Беш NT α-спиралынын позициялары (H1-H5)28 деп белгиленген.
рН <6,5 болгондо, HT димеризацияланып, ысыкка же мочевинадан келип чыккан денатурацияга туруштук берет18.NT димеризациясы жана туруктуулугу гелацияга кандай таасир этээрин түшүндүрүү үчүн 100 мг/мл NT камтыган эритмелер флакондун инверсия тестин колдонуу менен pH 8, 7 жана 6да көзөмөлдөндү.рН 8 жана 7де инкубацияланган NT үлгүлөрү 37 °Cде 30 мүнөттөн кийин гелдешти, бирок pH 8 гели тунук бойдон калды, ал эми рН 7 гелинде көрүнгөн чөкмө пайда болгон (сүрөт 5а).Ал эми, PH 6да HT камтыган эритме гель түзбөй, 37°Cде 20 мүнөттөн кийин чоң чөкмө пайда болушу мүмкүн.Бул димерлердин өздөрүн жана/же алардын мономерлерге салыштырмалуу жогорку туруктуулугун гелацияга жол бербөөнү көрсөтүп турат.РН 7 жана 6да NT үчүн чөкмөнүн пайда болушу күтүлгөн эмес, анткени NT 200 мг/мл27де эрийт, жылуулук менен денатурациялангандан кийин оңой кайра бүгөт, ошондой эле төмөнкү маанилерде α-спиралы кармайт. рН 18. Бул дал келбөөчүлүктөрдүн мүмкүн болгон түшүндүрмөсү, мурда билдирилген эксперименттер бөлмө температурасында же андан төмөн, же протеиндин салыштырмалуу төмөн концентрациясында жүргүзүлгөн16,18,19.
37°C инкубациялоодон кийин pH 8, 7, 6 жана 154 mM NaCl (рН 8) боюнча NT флакондун инверсия тести (100 мг/мл).b NT CD спектрлери тиешелүүлүгүнө жараша 154 мМ NaF жана 154 мМ NaCl менен жана жок.222 нм молярдык эллиптика табигый бүктөмөлөрдүн пропорциясына айланат.c NT инверсия анализи (100 мг/мл) NT* (37 °C жана 60 °C), NTA72R (37 °C) жана His-NT-L6 (37 °C жана 60 °C).d NT мутанттарынын CD спектрлери NT*, NTA72R жана His-NT-L6.222 нм молярдык эллиптика табигый бүктөмөлөрдүн пропорциясына айланат.e NTFlSp, NTMiSp жана кыскартылган NTMiSp (100 мг/мл) инверсия тести.Масштаб тилкеси 5 мм.f NT, NTFlSp, NTMiSp жана кыскартылган NTMiSp CD спектрлери.222 нм молярдык эллиптика табигый бүктөмөлөрдүн пропорциясына айланат.Толук NT спектрлери 25 °C жана 95 °C Кошумча 8-сүрөттө көрсөтүлгөн.
Туздун физиологиялык концентрациясы NT суббирдиктеринин ортосундагы электростатикалык өз ара аракеттенүүнү жана NT димеризациясын төмөнкү pH18ге өткөрүүнү аныктайт.Биз 154 mM NaCl жана NaF болушу чындап эле, тиешелүүлүгүнө жараша, гелацияга тоскоол болгондугун таптык (сүр. 5a, b; Кошумча 2б-сүрөт) жана бул туздар NT мономерлеринин жылуулук туруктуулугун жогорулатат (сүрөт. 5b, Кошумча 8-сүрөт). .Ал ошондой эле туруктуулукту жогорулатуу, тескерисинче, dimerization, гел пайда болушуна жол бербейт деп сунуш кылат.
Белоктун димеризациясынын жана гелдешүүдөгү туруктуулуктун ролун андан ары изилдөө үчүн биз эки мутантты, NT* жана NTA72R колдондук, алар да төмөнкү pH28.30 деңгээлинде мономердик бойдон калууда.NT* – кош зарядды кайтаруу мутанты, анда мономердин диполярдык зарядынын көрүнгөн бөлүштүрүлүшү тегизделген, бул димеризацияга жол бербейт жана мономердин туруктуулугун кескин жогорулатат.NTA72R заряддуу диполь, бирок Арг менен алмаштырылган Ала димердин чегинде жайгашкан, андыктан мутациялар димеризация үчүн талап кылынган суббирдиктин өз ара аракеттенүүсүнө тоскоол болот.37°С температурада инкубациялоодо NT* гидрогель түзбөйт, ал эми NTA72R 15 мүнөткө тунук эмес гелди түздү (5c-сүрөт).NT* жана NTA72R экөө тең димеризацияланбай, бирок мономердин туруктуулугу боюнча айырмалангандыктан (5d-сүрөт), бул жыйынтыктар жогорку термодинамикалык туруктуулук NTтин гелдешүүсүнө жол бербейт деп так көрсөтүп турат.Муну HT* жогорку температурада туруксуз болгондо (60°Сте 8 мүнөттөн кийин; 5в-сүрөт) гелди пайда кылуусу да ырастайт.Буга чейин NTдеги метиониндин жогорку мазмуну анын табигый бүктөлүшүн суюлтушу жана алты Met to Leu алмаштыргычтары (бул жерде His-NT-L6 деп аталат) NT46 мономерин катуу турукташтырып турганы мурда көрсөтүлгөн.Структуралык ийкемдүүлүк NT гелди түзүү үчүн талап кылынат деген божомолдун негизинде, биз His-NT-L6 туруктуу мутант 37 °C (Figure 5c, d) гели жок деп табылган.Бирок, His-NT-L6 да 60°С 60 мүнөт инкубациялоодо гель түздү (5c-сүрөт).
NTтин β-баракча структураларына айлануу жана гидрогельдерди түзүү жөндөмдүүлүгү спидроиндин бардык NT домендерине эмес, айрымдарына тиешелүү көрүнөт.Жибектин ар кандай түрлөрүнөн жана жөргөмүш түрлөрүнөн алынган NTs, Trichonephila clavipes (NTFlSp), алардын салыштырмалуу аз өлчөмдө метионинге жана жогорку жылуулук туруктуулугуна карабастан гелдерди түзүшкөн (сүр. 5e, f жана кошумча таблица 2).Ал эми Araneus ventricosus (NTMiSp) кичинекей ампулярдык белок спидроининен NT төмөн жылуулук туруктуулугу жана метиониндин жогорку мазмуну менен гидрогелдерди түзгөн эмес (Кошумча таблица 2 жана 5e, f).Акыркысы intramolecular disulfide байланыштар29,47 болушу менен байланыштуу болушу мүмкүн.NTMiSp дисульфиддик байланыштары азайганда ырааттуу түрдө 37°С 10 мүнөткө инкубациялангандан кийин гидрогель түздү (5е-сүрөт).Жыйынтыктап айтканда, структуралык ийкемдүүлүк NTден гелди түзүү үчүн маанилүү, бирок жалгыз критерий эмес экенин белгилей кетүү керек.Тиешелүү дагы бир фактор - бул амилоид фибрилдерин түзүүгө ыктуулук жана сыдырма базасы жана Вальс алгоритми менен жүргүзүлгөн анализ гелдерди түзүү жөндөмдүүлүгү менен амилоидогендик аймактардын болушунун, ошондой эле болжолдонгон аймактардын масштабынын ортосундагы корреляцияны көрсөттү. стерикалык сыдырмаларды түзүү.Корреляция болгон (Кошумча таблица 2 жана Кошумча 9-сүрөт).
Жагымдуу шарттарда NT фибрилдерди пайда кылуу жана гелдерди түзүү жөндөмү бизди башка белок фрагменттери менен NT синтези дагы эле синтез өнөктөштөрүнүн толук функциясы бар гелдерди түзө алат деген гипотезага алып келди.Муну текшерүү үчүн биз жашыл флуоресценттүү протеинди (GFP) жана пуриндик нуклеозид фосфорилазаны (PNP) NTтин C-терминусуна киргиздик.Жыйынтыгында биригүү протеиндери E. coliде өтө жогорку акыркы түшүмдүүлүк менен (150 мг/л жана 256 мг/л, His-NT-GFP жана His-NT-PNP үчүн колба маданияттары, тиешелүүлүгүнө жараша) көрсөтүлдү. NT менен бириктирилген башка белоктор үчүн Ref.30. Анын-NT-GFP (300мг / мл) жана анын-NT-PNP (100мг / мл) синтез белоктор 2 саат жана 6,5 сааттан кийин 37 ° C жана, маанилүү, GFP бөлүгү өзгөрүүсүз калган гелдерди пайда.гелдөөдөн кийин байкалган, гелдөөдөн кийин баштапкы флуоресценция интенсивдүүлүгүнүн >70% калган (сүрөт 6а).His-NT-PNP эритмелеринде жана гелдеринде PNP активдүүлүгүн өлчөө үчүн биз терүү протеинди NT менен суюлтууга туура келди, анткени таза препараттын ферментативдик активдүүлүгү гелдөө концентрациясында анализдин аныктоо диапазонунан тышкары болгон.0,01 мг/мл His-NT-PNP жана 100 мг/мл NT камтыган аралашма менен түзүлгөн гель алдын ала инкубацияланган үлгүлөрдүн баштапкы ферменттик активдүүлүгүнүн 65%ын сактап калган (сүрөт 6б).Гель өлчөө учурунда бүтүн бойдон калган (Кошумча 10-сүрөт).
a His-NT-GFP (300 мг/мл) жана His-NT-GFP гидрогелин (300 мг/мл) камтыган тескери флакондун көрүнгөн жана УК жарыгында гелациясына чейин жана андан кийинки салыштырмалуу флуоресценция интенсивдүүлүгү.Упайлар жеке өлчөөлөрдү көрсөтөт (n = 3), ката тилкелери стандарттык четтөөнү көрсөтөт.Орточо маани ката тилкелеринин ортосунда көрсөтүлөт.б PNP активдүүлүгү NT (100 мг/мл) жана 0,01 мг/мл анын-NT-PNP жана 100 мг/мл Жаңы Тайван долларынан турган аралашмадан турган эритмелерди жана гелдерди колдонуу менен флюорометрдик анализ аркылуу алынган.Киргизилгенде His-NT-PNP (5 мм масштабдуу тилке) камтыган гидрогели бар төңкөрүлгөн флакон көрсөтүлгөн.
Бул жерде биз NT жана башка рекомбинантты спидроин белокторунан гидрогелдердин пайда болушун 37°Cде протеин эритмесин инкубациялоо аркылуу билдиребиз (1-сүрөт).Желдөө α-спиралдардын β-кабатка айланышы жана амилоид сымал фибрилдердин пайда болушу менен байланышта экенин көрсөтөбүз (3 жана 4-сүрөттөр).Бул табылга таң калыштуу, анткени NTs бир нече күн бою 4°Cде >200 мг/мл концентрацияда өтө жогорку эригичтиги жана жогорку туруктуулугу менен белгилүү болгон ширетилген глобулярдуу беш спираль байламчалары.Кошумчалай кетсек, NTs протеиндин аз концентрациясында μMде жылуулук денатурациясынан кийин оңой эле бүктөлөт.Биздин натыйжаларга ылайык, фибрилдин пайда болушу >10 мг/мл протеин концентрациясынын жана бир аз жогорулатылган температуранын айкалышын талап кылат (1-сүрөт).Бул амилоид фибрилдери физиологиялык шарттарда 48 термикалык термелүүлөрдөн улам жарым-жартылай ачылбаган абалда болгон глобулярдуу бүктөлгөн белоктордон пайда болот деген ойго шайкеш келет.Бул конверсияга дуушар болгон протеиндердин мисалдарына инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин жана лизоцим кирет51,52,53.NT өзүнүн түпкү абалында α-спирал болсо да, полипептиддик чынжырдын болжол менен 65% стерикалык сыдырма түзүлүшү менен шайкеш келет (сүрөт 4e) 45.Мономер динамикалык мобилдүү болгондуктан, бул потенциалдуу амилоидогендик аймактарды орточо жогорулатылган температурада жана жалпы белоктун жогорку концентрациясында амилоид фибрилинин түзүлүшү үчүн критикалык концентрацияга жетиши мүмкүн.Бул ой жүгүртүүдөн кийин, биз спидроин концентрациясы менен гелдөө убактысынын ортосунда терс корреляцияны таптык (1c-сүрөт), жана эгерде мономердик NT конформациясы мутациялар (NT*, His-NT-L6) же туз кошуу менен турукташса, анда спазмдын алдын алат. пайда болуу гидрогелдери (5-сүрөт).
Көпчүлүк учурларда амилоид фибрилдери эритмеден чөкмө түрүндө жоголот, бирок белгилүү шарттарда алар гидрогельдерди пайда кылышы мүмкүн55,56,57.Гидрогель түзүүчү фибрилдер, адатта, жогорку пропорцияга ээ жана молекулярдык чырмалышуу аркылуу туруктуу үч өлчөмдүү тармактарды түзүшөт, 55,58 биздин натыйжаларга шайкеш келет.In vitro гидрогельдин пайда болушу үчүн белоктор көбүнчө толук же жарым-жартылай ачылат, мисалы, органикалык эриткичтердин, жогорку температуранын (70–90°C) жана/же төмөн рН (1,5–3,0) 59,60,61,62.Бул жерде сүрөттөлгөн spidroin hydrogels катаал иштетүүнү талап кылбайт, ошондой эле алар гидрогелдерди турукташтыруу үчүн кайчылаш байланыш агенттерин талап кылбайт.
Жибек жип ийрүү учурунда β-баракча алмашып жаткандай көрүнгөн спидроин кайталанат жана QDs гидрогельдерди түзөрү мурда кабарланган.Биздин табылгаларыбызга салыштырмалуу инкубация убакыттары жана/же инкубациялоо температурасы тиешелүүлүгүнө жараша кыйла узак же жогору болгон жана натыйжада гидрогельдер көбүнчө тунук эмес болгон (7-сүрөт жана 1-таблица) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Тез гел убактысынан тышкары, NT гидрогелдери >300 мг/мл (30%) бардык сүрөттөлгөн рекомбинантты жөргөмүш жибек протеининин гидрогелдеринен, ошондой эле желатин, альгинат (2%), агар (0,5%) сыяктуу табигый гидрогелдерден ашып кетти. ) жана коллаген.(0,6%) (7-сүрөт жана 1 жана 3 кошумча таблицалар)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Бул изилдөөдө гидрогелдердин гел убактысы жана ийкемдүү модулу башка спидроинге негизделген гидрогелдер жана тандалган табигый гидрогелдер менен салыштырылган.Шилтемелер гелация шарттарынын сүрөттөлүшү менен бирге берилет.APS Аммоний персульфаты, бөлмө температурасы.Маалыматтар 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Жөргөмүштөр спидроинди сактоо учурунда гелдин пайда болушуна жол бербөөнүн жолдорун иштеп чыгышкан окшойт.Жибек безинде белоктун жогорку концентрациясына карабастан, терминалдык домен менен байланышкан чоң кайталануучу аймак бул изилдөөнүн чегинде NT жана CT безинин көрүнгөн концентрациясы болжол менен 10-20 мг / мл туура келет дегенди билдирет.in vitro байкалган гидрогелдин пайда болушу үчүн зарыл.Мындан тышкары, туздардын окшош концентрациялары 16 жибек бездеринде (сүр. 5б) болуп, турукташтырылган NT.NT конформациясы E. coli цитозолунда изилденген жана in vitro изилденгенге караганда тыгыз бүктөлгөн, бул туз же башка факторлор анын in vivo агрегациясына тоскоол болоорун көрсөтүп турат.Бирок, NTs β-барак жипчелерине айландыруу жөндөмдүүлүгү жип пайда болушу үчүн маанилүү болушу мүмкүн жана келечектеги изилдөөлөр изилдениши керек.
Бул изилдөөдө байкалган NT-амилоид сымал фибрилдин жана гидрогелдин пайда болушунун жаңы аспектилеринен тышкары, биз бул кубулуштун биотехнологиялык жана биомедициналык колдонмолорго ээ болушу мүмкүн экенин көрсөтөбүз (сүрөт. 8).Концепциянын далили катары биз NTди GFP же PNP менен айкалыштырдык жана 37 °Cде инкубациялоодо синтез протеининин гидрогельдерди түзөөрүн жана GFP жана PNP фракциялары гелациядан кийин өз активдүүлүгүн негизинен сактап калаарын көрсөттүк (6-сүрөт).Нуклеозиддик фосфорилазалар нуклеозиддик аналогдордун75 синтезинин маанилүү катализаторлору болуп саналат, бул биздин ачылышыбызды биофармацевтика өнөр жайы үчүн актуалдуу кылат.Ыңгайлуу шарттарда тунук гидрогелдерди түзүүчү синтез протеиндерин экспрессиялоо концепциясы ферменттерди иммобилизациялоо, башкарылуучу дары-дармектерди чыгаруу жана кыртыш инженериясы сыяктуу колдонмолордун кеңири спектри үчүн жагымдуу касиеттери бар функционалдаштырылган гидрогелдерди түзүүгө мүмкүндүк берет.Кошумчалай кетсек, NT жана NT* эффективдүү экспрессия маркерлери30, бул NT жана анын варианттары эрүүчү синтез протеиндерин жогорку өндүрүмдүүлүктө өндүрүү жана андан кийин 3D гидрогелдеринде иммобилизацияланган максаттуу белокторду түзүү үчүн колдонулушу мүмкүн экенин билдирет.
NT эрүүчү, α-спиральдуу жана аз концентрацияда (μM) жана 37°Cде туруктуу.Ошол эле температурада, бирок концентрациясын жогорулатууда (>10 мг/мл) НТ амилоид сымал фибрилдерден турган гелдерди пайда кылат.NT синтез протеиндери ошондой эле толук функционалдык синтез фрагменттери бар фибриллярдык гелдерди түзүп, NT аркылуу ар кандай протеиндерди 3D гидрогелдеринде иммобилизациялоого мүмкүндүк берет.Төмөндө: NT (PDB: 4FBS) жана була тармактарынын жана аны менен байланышкан белок структураларынын сүрөттөрү (болжолдонгон жана масштабга тартылбаган, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4R).
Конструкциялар (амино-кислота ырааттуулугун камтыган толук тизме үчүн 4-кошумча таблицаны караңыз) pT7 плазмидине клондолуп, E. coli BL21ге (DE3) айландырылган.Инженердик плазмиддерди камтыган E. coli канамицин (70 мг/л) кошулган Luria сорпосу менен эмделди жана 30°C жана 250 айн/мин ылдамдыкта түн ичинде өстүрүлдү.Андан кийин культура канамицин камтыган LB чөйрөсүнө 1/100 сепилди жана OD600 0,8ге жеткенге чейин 30°C жана 110 айн/минутта өстүрүлдү.ЯМР изилдөөлөрү үчүн бактериялар изотоптор менен протеинди белгилөө үчүн 2 г D-глюкоза 13C (Олдрих) жана 1 г аммоний хлориди 15N (Кэмбридж изотоптору, Inc.) камтыган M9 минималдуу чөйрөсүндө өстүрүлгөн.Температураны 20 градус Цельсийге чейин төмөндөтүңүз жана 0,15 мМ изопропилтиогалактопиранозид (акыркы концентрация) менен белоктун экспрессиясын жаратыңыз.Түнкү протеин билдирүүдөн кийин, клеткалар 7278 × г, 4 ° C 20 мүнөттө жыйналды.Клетка гранулдары 20 mM Tris-HCl, рН 8 менен кайра суспензияланган жана андан ары колдонууга чейин тоңдурулган.Эриген клеткалар клетканы бузуучу (TS сериясындагы машиналар, Constant Systems Limited, Англия) менен 30 кПада лизистелген.Андан кийин лизаттарды 25000 г 30 мүнөт 4°С центрифугалашты.NTMiSp үчүн гранул 2 М карбамид, 20 мМ Tris-HCl, рН 8де кайра суспензияга салынып, 2 мүнөткө (2 с күйгүзүү/өчүрүү, 65%) ультрадыбыс менен иштетилди, андан кийин кайра 25 000 xg, 4° C ичинде центрифугаланган. 30 мүнөт.Супернатант Ni-NTA колоннасына жүктөлүп, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8 менен жууп, акырында протеин 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8 менен элюталанды. NT2Rep жана генерациялоо үчүн NTCT, тромбин сиңирүү Анын жана NT ортосундагы сайтты (ThrCleav) киргизет.Тромбиндин бөлүнүү жерлери His-NT-ThrCleav-2Rep (2Rep чыгарат), His-thoredoxin-ThrCleav-NT (NT өндүрөт), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (КТ өндүрөт), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT да бар. .* (NT* чыгарат), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R чыгарат), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp чыгарат) жана Гис-Күкүрт Редоксин-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp чыгарат).Конструкциялар тромбин менен сиңирилген (1:1000) жана 6-8 кДа молекулярдык салмагы босогосу бар Spectra/Por диализ мембранасын колдонуу менен 20 mM Tris-HCl, рН 8 менен 4°Cде түнү диализдешти.Диализден кийин эритме Ni-NTA колоннасына жүктөлөт жана кызыккан протеинди камтыган агынды суулар чогултулат.Протеиндердин концентрациясы өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык Брэдфорд анализин колдонгон NTF1Sp кошпогондо, ар бир протеиндин өчүү коэффициентин колдонуу менен 280 нмде УК сиңирүүсүн өлчөө жолу менен аныкталган.Тазалык SDS полиакриламид (4-20%) гел электрофорез жана Coomassie жаркыраган көк боек менен аныкталган.Белоктор центрифуга фильтрлери (VivaSpin 20, GE Healthcare) менен 4000 xg 20 мүнөттүк циклде 10 кДа молекулярдык салмакты чектөө менен топтолгон.
Протеин эритмесин эритип, 1 мл тунук септум флаконуна (8 x 40 мм Thermo Scientific) кылдаттык менен 150 мкл пипетиңиз.Түтүктөрдүн капкагы жабылып, бууланбаш үчүн парафильм менен жабылган.Үлгүлөр (n = 3) 37°C же 60°C температурада инкубацияланган жана гелацияны байкоо үчүн мезгил-мезгили менен тескери жасалган.Гель жок үлгүлөр жок дегенде бир жума инкубацияланган.10 μM протеинге 10 мм DTT менен NTMiSp дисульфиддик байланыштарды азайтыңыз.Табигый жөргөмүш жибек жабуунун гелациясын талдоо үчүн швед көпүрөсүнүн жөргөмөгү кесилип, эки негизги ампулацияланган бездер 200 мкл 20 мМ Tris-HCl буферинин рН 8ине салынып, жабуунун бездерден бөлүнүшү үчүн кесилген..Бездердин мазмуну буферде эрийт, кургак салмакты аныктоо үчүн 50 мкл (ачык флакондорду 60 °C туруктуу салмакка чейин инкубациялоо менен) жана 37 °Cде гелдөө үчүн 150 мкл.
Өлчөө геометриясы / куралы дат баспас болоттон жасалган, үстүнкү диаметри 20 мм жана 0,5 мм боштук менен параллелдүү плитаны колдонуу менен.Үлгүнү 25 °Cден 45 °Cге чейин жана кайра 25 °Cге чейин дат баспас болоттон жасалган түбү Peltier плитасын колдонуу менен мүнөтүнө 1 °C ылдамдыкта ысытыңыз.Вибрациялык өлчөөлөр 0,1 Гц жыштыкта ​​жана 100 мг/мл жана 300-500 мг/мл үлгүлөр үчүн 5% жана 0,5% штаммда материалдын сызыктуу илешкектик аймагында жүргүзүлдү.буулануунун алдын алуу үчүн атайын нымдуулук камерасын колдонуңуз.Маалымат Prism 9 аркылуу талданган.
Бөлмө температурасында 800дөн 3900 см–1ге чейинки инфракызыл (IR) спектрлерди чогултуу үчүн.ATR аппараты, ошондой эле спектрометр аркылуу жарык жолу, эксперимент алдында жана анын жүрүшүндө кургак чыпкаланган аба менен тазаланат.Эритмелер (500 мг/мл спектрлердеги суунун сиңирүү чокуларын азайтуу үчүн) кристаллдарга пипетка менен куюлуп, өлчөө алдында гелдер (500 мг/мл) түзүлүп, андан кийин кристаллдарга өткөрүлүп берилди (n = 3).1000 сканерлөө 2 см-1 токтому жана нөл милдети цикли 2 менен жазылган. Экинчи туунду OPUS (Брукер) менен тогуз баллдык текшилөө диапазонун колдонуу менен эсептелген.Спектрлер 1720 жана 1580 см-1 ортосундагы ошол эле интеграциялык аймакка нормалдаштырылган Ф.Менгес "Spectragryph - оптикалык спектроскопиялык программалык камсыздоо".ATR-IR спектроскопиясында инфракызыл нурдун үлгүгө кирүү тереңдиги толкун санына көз каранды, натыйжада жогорку толкун сандарына караганда төмөнкү толкун сандарында күчтүү жутулууга алып келет.Бул эффекттер сүрөттө көрсөтүлгөн спектрлер үчүн оңдолгон эмес.3, анткени алар абдан кичинекей (Кошумча 4-сүрөт).Бул көрсөткүч үчүн оңдолгон спектрлер Bruker OPUS программасы аркылуу эсептелген.
Принцибинде, белоктун конформацияларынын комплекстуу сандык аныкталышы амид I чокусунун чегинде компоненттердин ишенимдуу деконволюциясынан кийин мумкун болот.Бирок, иш жүзүндө кээ бир тоскоолдуктар пайда болот.Спектрдеги ызы-чуу деконволюция учурунда (жалган) чокулар катары пайда болушу мүмкүн.Кошумчалай кетсек, суунун ийилишинен улам чокусу амид I чокусунун абалына дал келет жана бул жерде изилденген суулуу гел сыяктуу көп сандагы сууну камтыган үлгүлөр үчүн ушундай чоңдукка ээ болушу мүмкүн.Ошондуктан, биз амид I чокусун толугу менен ажыратуу аракетин көргөн жокпуз жана биздин байкоолорубуз ЯМР спектроскопиясы сыяктуу башка ыкмаларды колдоо үчүн гана каралышы керек.
50 мг/мл NT жана His-NT2RepCT эритмелери 37°Cде түн ичинде гелдешти.Андан кийин гидрогель 20 мМ Tris-HCl (рН 8) менен 12,5 мг/мл концентрацияга чейин суюлтулуп, жакшылап чайкалып, гелди сындыруу үчүн пипетка менен куюлган.Андан кийин гидрогель 20 мМ Tris-HCl (рН 8) менен 10 жолу суюлтулуп, 5 мкл үлгү формвар менен капталган жез торуна колдонулуп, ашыкча үлгү тазалоочу кагаз менен алынып салынды.Үлгүлөр эки жолу 5 мкл MilliQ суусу менен жуулду жана 1% уранил форматы менен 5 мүнөткө боёлот.Ашыкча такты соргуч кагаз менен алып салыңыз, андан кийин торду аба менен кургатыңыз.Сүрөттөө бул торлордо 100 кВда иштеген FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN аркылуу аткарылган.Сүрөттөр Veleta 2k × 2k CCD камерасы (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстер, Германия) аркылуу x 26 500 жана x 43 000 чоңойтууда жазылган.Ар бир үлгү (n = 1) үчүн 10-15 сүрөт жазылган.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) була диаметри (n = 100, ар кандай жипчелер) сүрөт талдоо жана өлчөө үчүн колдонулган.Призма 9 жупташтырылбаган t-тесттерди (эки куйруктуу) аткаруу үчүн колдонулган.Орточо His-NT2RepCT жана NT фибрилдери тиешелүүлүгүнө жараша 11.43 (SD 2.035) жана 7.67 (SD 1.389) нм болгон.Ишеним аралыгы (95%) -4,246дан -3,275ке чейин.эркиндик даражасы = 198, б < 0,0001.
10 мкМ тиофлавин T (ThT) камтыган 80 мкл суюк үлгүлөр үч нускада (n = 3) Corning 96 көзөнөктүү кара түбү тунук түбүндөгү пластинкаларын (Corning Glass 3881, АКШ) колдонуу менен статикалык шарттарда өлчөнгөн.Флуоресценттик айырмачылыктар 440 нм дүүлүктүрүү чыпкасы жана 480 нм эмиссия чыпкасы (BMG Labtech, Оффенбург, Германиядан FLUOStar Galaxy) аркылуу жазылган.ThT сигналы каныккан да, өчүрүлгөн да эмес, анткени ThT ар кандай концентрациялары менен эксперименттер сигналдын интенсивдүүлүгүн өзгөртпөстөн жүргүзүлгөн.Туманды өлчөө үчүн 360 нмде рекорддук абсорбент.Үрөн себүү эксперименттери үчүн 100 мг/мл гелдер 37°С температурада түзүлүп, кайра суспензияланган жана 5%, 10% жана 20% молярдык катышта себүү үчүн колдонулган.Маалымат Prism 9 аркылуу талданган.
His-NT2RepCT жана NT >100 мг/мл запастарын музда эритип, 0,22 мкм фильтр аркылуу чыпкалаңыз.Концентрациялар Nanodrop жардамы менен 280 нм абсорбенцияны өлчөө жолу менен эсептелген.Тунук түбү бар 96 скважиналуу кара байланышпаган пластинканын (Корнинг) кудуктарында үлгүлөр 20 мг/мл 20 мМ Tris-HCl pH 8де суюлтулган жана 5 мкм ThT (акыркы концентрация), үлгүнүн жалпы концентрациясы менен аралаштырылды. 50 мкл көлөмү.Үлгүлөр ThT сүрөттөө үчүн өткөрүлүүчү жарык каналы жана FITC дүүлүктүрүү жана эмиссия чыпкалары бар CellObserver (Zeiss) микроскопунда 37 °Cде ар 10 мүнөт сайын сүрөткө тартылды.Сүрөткө тартуу үчүн 20x/0,4 линза колдонулат.Сүрөттү анализдөө үчүн Zen Blue (Zeiss) жана ImageJ (https://imagej.nih.gov/) колдонулган.Гельдер ошондой эле NT жана His-NT2RepCT эритмелеринен 20 mM Tris pH 8 жана 5 μM ThT камтыган 50 мг/мл концентрациясында даярдалып, 37°Cде 90 мүнөт инкубацияланган.Гель бөлүктөрү 20 mM Tris, pH 8 жана 5 μM ThT камтыган жаңы кудукка өткөрүлүп берилди, анда кара 96 скважина тунук түбү такталган.20x/0,4 чоңойтууда жашыл флуоресценция жана жаркыраган талаа сүрөттөрүн алыңыз.ImageJ сүрөт талдоо үчүн колдонулган.
Чечимдин ЯМР спектрлери QCI Quadrupole Resonance Impulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) менен жабдылган 600 MHz Bruker Avance Neo спектрометринде 310 Кда алынган.13C, 15N менен белгиленген 10 мг/мл бир тектүү протеинди камтыган ЯМР үлгүлөрү, 20 mM Tris-HCl (рН 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) эриген. .PH 6.7 боюнча NT2RepCT химиялык жылыштары 15N-HSQC 2D спектринде 23 чокусун дайындоо үчүн колдонулган.
13C, 15N-белгиленген гидрогелдердин сыйкырдуу бурч айлануучу катуу ЯМР (MAS) спектрлери 3,2 мм 13C/15N{1H} электронсуз зонд менен жабдылган 800 МГц Bruker Avance III HD спектрометринде жазылган.Үлгү температурасы 277 К өзгөрүлмө температурадагы газ агымынын жардамы менен көзөмөлдөнгөн. Эки өлчөмдүү диполдук айлануучу резонанс (DARR)76 жана радио жыштыктын кайра кошулуусу (RFDR)77 спектрлери, тиешелүүлүгүнө жараша, 12,5 кГц жана 20 кГц MAS жыштыктарында алынган.1Н дан 13Сге чейинки кайчылаш поляризация (CP) 1Н 60,0дон 48,0 кГцге чейинки сызыктуу рампаны, 13Cде 61,3/71,6 кГц (12,5/20 кГц МАС) жана байланыш убактысы 0,5–1 мс аркылуу аткарылган.Маалыматтарды чогултуу учурунда Spinal6478 73,5 кГц жыштыктагы ажыратуу колдонулган.алуу убактысы 10 миллисекунд жана цикл кечигүү 2,5 секунд болду.RFDR спектрлеринде байкалган бир-байланыштуу Cα/Cβ корреляциялары DARR спектрлериндеги мүнөздүү калдык түрүндөгү химиялык жылыштардын жана көбөйтүлгөн байланыштардын негизинде дайындалган.
Zipper79 маалымат базасы (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) NT, NTFlSp жана NTMiSp үчүн флютер тенденцияларын жана Rosetta энергиясын баалоо үчүн колдонулган.Zipper маалымат базасы белоктун структурасын моделдөө жана талдоо үчүн бир нече эркин энергия функцияларын бириктирген Rosetta Energy80ди эсептейт.-23 ккал/моль же андан төмөн энергия деңгээли фибрилляцияга жогорку тенденцияны көрсөтөт.Төмөнкү энергия сыдырма конформациясындагы эки β-тектин көбүрөөк туруктуулугун билдирет.Мындан тышкары, Waltz алгоритми NT, NTFlSp жана NTMiSp Ref амилоидогендик аймактарды болжолдоо үчүн колдонулган.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT протеин эритмеси рН 6 жана 7ге чейин төмөндөтүү үчүн рН 5,5 жана 6,0 боюнча 2-(N-морфолино)этансульфон кислотасы (МЭС) буфери менен аралаштырылды.Акыркы белок концентрациясы 100 мг/мл болгон.
Ченөөлөр J-1500 CD спектрометринде (JASCO, АКШ) оптикалык жолу 0,1 см болгон 300 мкл кюветти колдонуу менен аткарылды.Белоктор 20 мМ фосфат буферинде (рН 8) 10 мкм (n = 1) чейин суюлтулган.Туздун катышуусунда белоктун туруктуулугун талдоо үчүн протеиндер тиешелүүлүгүнө жараша 154 мМ NaF же NaCl камтыган 20 мМ фосфат буферинде (рН 8) ошол эле концентрацияда (n = 1) талданды.Температура сканерлери 222 нмде 25°Cден 95°Cге чейин 1°С/мин жылытуу ылдамдыгы менен жазылган.Түпкү бүктөлгөн протеиндердин үлүшү (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) формуласы менен эсептелген.Кошумчалай кетсек, ар бир үлгү үчүн 260 нмден 190 нмге чейин 25°Cде жана 95°Сге чейин ысыткандан кийин беш спектр жазылган.Беш спектр орточо алынган, тегизделген жана молярдык эллиптикага айландырылган.Маалымат Prism 9 аркылуу талданган.
His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкл) флуоресценция интенсивдүүлүгү статикалык шарттарда түбү кара тунук 96 көзөнөктүү Корнинг пластинкаларында үч нускада (n = 3) өлчөнгөн (Corning Glass 3881, АКШ).Үлгүлөрдү дүүлүктүрүүчү толкун узундугу 395 нм болгон флуоресценциянын негизиндеги пластина окугучу менен өлчөп, гелацияга чейин 509 нмде жана 2 сааттан кийин 37°Cде эмиссияны жазыңыз.Маалымат Prism 9 менен анализденди.
Пуриндик нуклеозид-фосфорилаза активдүүлүгүн текшерүү комплекти (флюорометриялык ыкма, Сигма Олдрих) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык колдонулган.Гис-NT-PNP камтыган гелдердеги жана эритмелердеги активдүүлүктү өлчөө үчүн 10 нг His-NT-PNP менен 100 мг/мл NT менен 2 мкл жалпы көлөмүн аралаштырыңыз, анткени гел топтомдун аныктоо интервалынан жогору сигнал берген.His-NT-PNP жок гелдерди жана эритмелерди башкаруу камтылган.Өлчөө эки жолу жүргүзүлдү (n = 2).Активдүүлүк өлчөнгөндөн кийин реакция аралашмасы алынып салынды жана өлчөө учурунда гелдин бүтүн бойдон калышын камсыз кылуу үчүн гель сүрөткө тартылды.Маалымат Prism 9 аркылуу талданган.
Изилдөө дизайны жөнүндө көбүрөөк маалымат алуу үчүн, бул макалага шилтемеленген Табиятты изилдөө рефератын караңыз.
1 жана 2-сүрөттөр баштапкы маалыматтарды берет.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, жана 6, Кошумча сүрөт.3, кошумча сүрөт.5a, d, кошумча сүрөт.6 жана кошумча фиг.8. Бул изилдөөнүн маалыматтары Zenodo маалымат базасында жайгаштырылган https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Бул изилдөөдө алынган NMR маалыматтары BMRBig репозиторийине bmrbig36 кирүү ID астында жайгаштырылган.GFP жана PNP структуралары PDBден алынган (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. жана Johansson, J. Spinning жасалма жөргөмүш жибек.Улуттук химиялык.биология.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes геному жөргөмүш жибек гендердин ар түрдүүлүгүн жана алардын татаал экспрессиясын баса белгилейт.National Genette.49, 895–903 (2017).