347 12,7*1,24мм Дат баспас болоттон жасалган бурмаланган түтүк, синхрондук электростатикалык конденсациянын жана α-синуклеин менен таудун коагрегациясынын молекулярдык механизми

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Ар бир слайдда үч макала көрсөтүлгөн слайдерлер.Слайддар аркылуу өтүү үчүн артка жана кийинки баскычтарды же ар бир слайд аркылуу жылуу үчүн аягындагы слайд контроллер баскычтарын колдонуңуз.

347 Дат баспас болоттон жасалган түтүктүн спецификациясы

347 12,7 * 1,24 мм Дат баспас болоттон жасалган бурмаланган түтүк

Сырткы диаметри: 6,00 мм OD чейин 914,4 мм OD чейин, Өлчөмдөрү 24 "NB чейин жеткиликтүү Ex-запаста, OD өлчөмү болот түтүктөр бар Ex-запаста

SS 347 Түтүк калыңдыгы диапазону: 0,3 мм – 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ж.б. (0,5-12 мм) Же талапка ылайык ыңгайлаштырылуучу кадимки эмес өлчөмү

Түрү: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW түтүктөрү |SS 347 ширетилген түтүктөр |SS 347 Фабрикалык түтүктөр |SS 347 CDW түтүктөрү, LSAW түтүктөрү / тигиш менен ширетилген / кайра чийилген

Форма: SS 347 тегерек түтүктөр/ түтүктөр, SS 347 чарчы түтүктөр/ түтүктөр, SS 347 тик бурчтуу түтүктөр/ түтүктөр, SS 347 ширелүү түтүктөр, SS 347 “U” формасы, SS 347 пан торт катушкалар, SS 347 гидравликалык түтүктөр

Узундугу: Бир кокустук, кош кокустук жана талап кылынган узундуктун аягы: түз аягы, ийилген учу, тебеленген

Акыркы коргоо: Пластикалык капкактар ​​|Сырткы финиш: Дат баспас болоттон жасалган түтүктөр үчүн 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish, Кардардын талаптары боюнча бүтүрүү

Жеткирүү шарты: күйдүрүлгөн жана туздалган, жылтыратылган, ачык күйдүрүлгөн, муздак тартылган

Текшерүү, Сыноо отчеттору: Тегирмендин Сыноо Сертификаттары, EN 10204 3.1, Химиялык Отчеттор, Механикалык Отчеттор, PMI Сыноо Отчеттору, Визуалдык Инспекция Отчеттору, Үчүнчү Тарап Инспекция Отчеттору, NABL Бекитилген Лабораториялык Отчеттору, Кыйратуучу Сыноо Отчеттору, Кыйратуучу Сыноо Отчеттору

Таңгактоо: жыгач кутуларга, желим баштыктарга, болот тилкелерге таңгакталган же кардарлардын суроо-талабы боюнча

Атайын сунуштар: Өлчөмдөр жана спецификациялар жогоруда көрсөтүлгөндөн башка талап боюнча даярдалышы мүмкүн

SS 347 түтүктүн өлчөмү диапазону: 1/2 дюймдук NB, ODдан 24 дюймга чейин

ASTM A312 347: Тиксиз жана түз тигиш ширетилген аустениттик түтүк жогорку температура жана жалпы коррозияга каршы кызмат үчүн арналган.Ширетүү учурунда металлды толтурууга жол берилбейт.

ASTM A358 347: Коррозиялык жана/же жогорку температурадагы тейлөө үчүн электр ширетүү аустениттик түтүк.Адатта, бул спецификацияга 8 дюймга чейинки түтүк гана чыгарылат.Ширетүү учурунда толтуруучу металлды кошууга жол берилет.

ASTM A790 347: Тиксиз жана түз тигиш ширетилген ферриттик/аустениттик (дуплекстүү) түтүк жалпы коррозияга каршы кызмат көрсөтүүгө арналган, өзгөчө басым жасоо менен стресстик коррозияга каршы крекингге туруштук берүү.

ASTM A409 347: Түз тигиш же спиралдык тигиш электр ширетүү чоң диаметри аустениттик жарык дубал түтүк дат жана/же жогорку үчүн дубалдары Sch5S жана Sch 10S менен 14 "30" өлчөмүндө

ASTM A376 347: Жогорку температурадагы колдонмолор үчүн тиксиз аустениттик түтүк.

ASTM A813 347: Бир тигиш, бир же эки ширетилген аустениттик түтүк жогорку температура жана жалпы коррозияга каршы колдонулат.

ASTM A814 347: Муздак иштетилген ширетилген аустениттик түтүк жогорку температура жана жалпы коррозиялык кызмат үчүн.

347H Дат баспас болоттон жасалган түтүктөр Химиялык курамы

Дат баспас болоттон жасалган 347H түтүктүн механикалык касиеттери

Дат баспас болоттон жасалган 347H түтүктөр физикалык касиеттери

347H Дат баспас болоттон жасалган түтүк үчүн эквиваленттүү класстар

Амилоиддик альфа-синуклеиндин (αS) агрегациясы Паркинсон оорусуна жана башка синуклеинопатияларга мүнөздүү.Жакында, адатта, Альцгеймер оорусу менен байланышкан tau протеин αS патологиясы менен байланышкан жана эки белоктордун коагрегациясынын молекулярдык механизми түшүнүксүз бойдон калууда, бирок αS-бай кошулмаларда биргелешип локализацияланат.Биз бул жерде αS фазасы tau сыяктуу оң заряддуу полипептиддер менен электростатикалык комплекстүү конденсация аркылуу суюк конденсаттарга бөлүнөрүн билдиребиз.Поликатиондорго αS жакындыгына жана коагуляция тармагынын валенттүүлүгүнүн азайышынын ылдамдыгына жараша уюган тромбтар тез гелдешүү же коалесценцияга, андан соң жай амилоиддик агрегацияга өтөт.Өркүндөтүлгөн биофизикалык ыкмалардын комплексин бириктирүү менен биз суюктук-суюктук αS/Tau фазасынын бөлүнүшүн мүнөздөй алдык жана суюк протеин конденсатында эки белокторду камтыган гетерогендүү агрегаттардын пайда болушуна алып келген негизги факторлорду аныктай алдык.
Мембраналык бөлүмдөрдөн тышкары, клеткалардагы мейкиндиктик бөлүнүүнү суюктук-суюк фазалык бөлүнүү (LLPS) деп аталган процесс аркылуу биомолекулярдык конденсат же тамчылар деп аталган протеинге бай, суюктук сымал жыш денелердин пайда болушу менен да жетишүүгө болот.Бул тамчылар көбүнчө белоктордун же белоктордун жана РНКнын ортосундагы көп валенттүү убактылуу өз ара аракеттенүүдөн пайда болот жана дээрлик бардык тирүү системаларда ар кандай функцияларды аткарышат.LLP-жөндөмдүү белоктордун көп саны табиятта жана биомолекулярдык конденсаттардын пайда болушунда өтө тартипсиз болгон төмөн татаалдыктагы ырааттуулуктарды көрсөтөт3,4,5.Көптөгөн эксперименталдык изилдөөлөр бул суюктук сымал конденсаттарды түзүүчү белоктордун ийкемдүү, көбүнчө иретсиз жана көп валенттүү табиятын аныктады, бирок бул конденсаттардын катуураак конденсаттарга чейин өсүшүн жана жетилишин көзөмөлдөгөн спецификалык молекулярдык детерминанттар жөнүндө аз эле белгилүү. мамлекет..
Жаңы маалыматтар аберрантты протеин менен башкарылган LLPS жана тамчылардын катуу структураларга айлануусу көбүнчө дегенеративдик оорулардын белгилери болуп саналган эрибеген уулуу агрегаттардын пайда болушуна алып баруучу тиешелүү уюлдук жолдор болушу мүмкүн деген гипотезаны колдойт.Көптөгөн LLPS менен байланышкан ички тартипсиз протеиндер (IDPs), көбүнчө жогорку заряддуу жана ийкемдүү, амилоиддик агрегация процесси аркылуу нейродегенерация менен көптөн бери байланышып келген.Атап айтканда, FUS7 же TDP-438 сыяктуу биомолекулярдык IDP конденсаттары же hnRNPA19 сыяктуу чоң татаалдыгы аз домендерге ээ протеиндер суюктук деп аталган процесс аркылуу гел сымал, ал тургай катуу формаларга карылары көрсөтүлгөн.кошулма.катуу фазага өтүү (LSPT) убакыттын функциясы катары же белгилүү бир пост-трансляциялык модификацияларга же патологиялык маанилүү мутацияларга жооп катары1,7.
LLPS менен байланышкан дагы бир IDP in vivo бул Tau, микротүтүкчөлөр менен байланышкан бузулган протеин, анын амилоиддик агрегациясы Альцгеймер оорусуна10 катышкан, бирок жакында эле Паркинсон оорусуна (PD) жана башка синаптикалык ядролук протеинопатияларга 11, 12, 13 байланыштуу.Тау жагымдуу электростатикалык өз ара аракеттенүүдө14 улам эритмеден/цитоплазмадан өзүнөн-өзү ажырай тургандыгы көрсөтүлгөн, натыйжада электростатикалык коацерваттар деп аталган тауга байыган тамчылар пайда болот.Ошондой эле спецификалык эмес өз ара аракеттенүүнүн бул түрү жаратылыштагы көптөгөн биомолекулярдык конденсаттардын кыймылдаткыч күчү экендиги байкалган15.Тау протеининде электростатикалык агрегация жөнөкөй агрегация жолу менен түзүлүшү мүмкүн, мында протеиндин карама-каршы заряддуу аймактары бөлүнүү процессин козгойт, же РНК сыяктуу терс заряддуу полимерлер менен өз ара аракеттенүү аркылуу татаал агрегация аркылуу түзүлүшү мүмкүн.
Жакында эле, α-синуклеин (αS), PD жана башка нейродегенеративдик оорулар менен коштолгон амилоиддик IDP, синуклеинопатия17,18 катары белгилүү, суюктук сыяктуу жүрүм-туруму менен белок конденсаттарында топтолгон уюлдук жана жаныбарлардын моделдеринде 19,20 көрсөтүлгөн.In vitro изилдөөлөр көрсөткөндөй, αS негизинен гидрофобдук өз ара аракеттенүү аркылуу жөнөкөй агрегация жолу менен LLPS дуушар кылат, бирок бул процесс өзгөчө жогорку протеин концентрациясын жана атиптик узак инкубация убакыттарын талап кылат19,21.In vivo байкалган αS камтыган конденсаттар ушул же башка LLPS процесстери аркылуу түзүлөбү, чечилбеген негизги маселе бойдон калууда.Ошо сыяктуу эле, αS амилоидинин агрегациясы PD жана башка синуклеинопатиялардагы нейрондордо байкалганы менен, αS клетка ичиндеги амилоиддик агрегациядан өтүшүнүн так механизми белгисиз бойдон калууда, анткени бул протеиндин ашыкча экспрессиясы бул процессти өзүнөн өзү козгобойт.Кошумча уюлдук зыян көп учурда талап кылынат, бул клетка ичиндеги αS амилоиддик жыйындарды ренуклеациялоо үчүн белгилүү бир уюлдук жерлер же микро чөйрөлөр талап кылынат.Агрегацияга өзгөчө жакын болгон бир клеткалык чөйрө белок конденсаттарынын 23 ички болушу мүмкүн.
Кызыктуусу, αS жана tau Паркинсон оорусу жана башка синуклеинопатиялары бар адамдарда мүнөздүү оорулардын кошулмаларында биргелешип локализацияланганы аныкталды 24,25 жана эксперименттер эки протеиндин ортосундагы синергетикалык патологиялык байланышты билдирди 26,27, бул αS жана tau агрегациясынын ортосундагы потенциалдуу байланышты сунуштады. нейродегенеративдик ооруларда.оору.αS жана tau өз ара аракеттенүү жана бири-биринин агрегациясын илгерилетүү үчүн табылган in vitro жана in vivo 28,29 жана бул эки белоктордон турган гетерогендүү агрегаттар synucleinopathies 30 менен ооругандардын мээсинде байкалган.Бирок, αS жана tau ортосундагы өз ара аракеттенүүнүн молекулярдык негиздери жана анын коагрегация механизми жөнүндө аз маалымат бар.αS αS жогорку терс заряддуу С-терминал аймагы менен таудун борбордук пролинге бай аймагынын ортосундагы электростатикалык тартылуу аркылуу tau менен өз ара аракеттенишет, ал дагы оң заряддуу калдыктарга байыйт.
Бул изилдөөдө, биз αS чындап эле, поли-L-лизин (pLK) жана бул процессте башка оң заряддуу полипептиддер менен өз ара аракеттенүүдөн айырмаланып, tau протеининин катышуусунда электростатикалык комплекстүү конденсация аркылуу тамчыларга ажырай аларын көрсөтөбүз.αS тамчы тармагы үчүн склад молекуласы катары иштейт.Биз электростатикалык αS коацерваттарынын жетилүү процессиндеги байкаларлык айырмачылыктарды аныктадык, алар коацерват тармагына катышкан белоктордун өз ара аракеттешүүсүнүн валенттүүлүгүнүн жана күчүндөгү айырмачылыктар менен байланышкан.Кызыктуусу, биз αS жана tau амилоид протеиндеринин узак мөөнөттүү суюк коацерваттарда биргелешип агрегацияланышын байкадык жана мындай коацерваттарда бул эки белоктордун биргелешип биригишине алып келген кээ бир негизги факторлорду аныктадык.Бул жерде биз бул процессти майда-чүйдөсүнө чейин сүрөттөп беребиз, бул оорунун өзгөчө кошулмаларындагы эки белоктордун коллокализациясынын негизинде жаткан молекулярдык механизм.
αS нейтралдуу рНда жогорку аниондук C-терминалдык куйругу бар (сүрөт 1а), жана биз ал поликатиондук тартипсиз полипептиддик молекулалар менен электростатикалык комплекстердин конденсацияланышы аркылуу LLPSке өтүшү мүмкүн деп божомолдодук.Нейтралдуу рН 32де оң заряддуу жана иретсиз полимердик табиятынан улам биз баштапкы моделдин молекуласы катары 100 калдыктуу поли-L-лизинди (pLK) колдондук. Биринчиден, pLK αSнын Ct домени менен эритме NMR спектроскопиясы аркылуу өз ара аракеттенишин тастыктадык. (Figure 1b) жогорулатуу αS катышуусунда 13C/15N-белгиленген αS колдонуу: pLK молярдык катышы.pLK менен αSнын Ct-домени менен өз ара аракеттенүүсү химиялык жылыштын бузулушунан жана белоктун бул аймагындагы эң жогорку интенсивдүүлүктүн төмөндөшүндө көрүнөт.Кызыктуусу, биз αS менен pLK менен αS концентрациясын болжол менен аралаштырганда.Полиэтиленгликолдун (5–15% PEG-8) катышуусунда 5–25 мкМ (типтүү LLPS буфери: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) биз дароо протеин пайда болушунун кеңири талаасынан өттүк. .тамчылар флуоресценция (WF) жана жаркыраган талаа (BF) микроскопиясынын жардамы менен байкалган (сүрөт 1c).Концентрацияланган αS камтыган 1-5 мкм тамчылар (кошулган 1 μM AlexaFluor488-белгиленген αS, AF488-αS), алардын электростатикалык касиеттери 10% 1,6-гександиолго (1,6-HD) жана анын сезгичтигинен алынышы мүмкүн. NaCl концентрациясынын жогорулашы (сүрөт 1c).αS/pLK электростатикалык комплексинин коацерваттарынын суюктук сымал табияты алардын миллисекунддардын ичинде биригип кетүү жөндөмдүүлүгү менен көрсөтүлөт (1d-сүрөт).Турбидиметрияны колдонуу менен, биз бул шарттарда тамчылардын пайда болушунун сандык көрсөткүчтөрүн аныктадык, анын туруктуулугу менен байланышкан негизги өз ара аракеттенүүнүн электростатикалык мүнөзүн тастыктадык (сүрөт 1e) жана LLPS процессине ар кандай полимер катыштарынын таасирин бааладык (1f-сүрөт).Тамчылардын пайда болушу полимердик катыштардын кеңири диапазонунда байкалганы менен, процесс pLK αS ашык болгондо абдан жагымдуу болот.ЖЧКлар ошондой эле химиялык жактан ар түрдүү алмаштыруучу агент декстран-70 (70 кДа) же ар кандай үлгү форматтарын, анын ичинде айнек слайд тамчыларын, ар кандай материалдардан жасалган микропластинка кудуктарын, Эппендорф же кварц капиллярларын колдонуу менен байкалган.
Бул изилдөөдө колдонулган WT-αS жана ΔCt-αS варианттарында ар кандай белок аймактарынын схемалык өкүлчүлүгү.Амфипатикалык N-терминал домени, гидрофобдук амилоид түзүүчү (NAC) аймак жана терс заряддуу С-терминалдык домен тиешелүүлүгүнө жараша көк, кызгылт сары жана кызыл түстө көрсөтүлгөн.WT-αSтин таза заряды (NCPR) картасы көрсөтүлгөн.б макромолекулярдык топтордун жоктугунда αS / pLK өз ара аракеттенүүсүнүн ЯМР анализи.pLK концентрациясы жогорулаган сайын (αS: pLK молярдык катышы 1:0,5, 1:1,5 жана 1:10, тиешелүүлүгүнө жараша ачык жашыл, жашыл жана кочкул жашыл түстө көрсөтүлгөн).c LLPS буферинде αS/pLK (молярдык катышы 1:10) 25 мкМде (1 μM AF488-белгиленген αS же Atto647N-белгиленген pLK WF сүрөттөө үчүн) LLPS буферинде (жогоруда) же 500 mM NaCl менен толукталат (төмөндө10) % 1,6-гександиол (1,6-HD; төмөнкү оң жакта).Масштаб тилкеси = 20 мкм.г 25 мкм концентрациясында αS/pLK (молярдык катышы 1:10) BF тамчы биригүү өкүлү микроскопиялык сүрөттөр;жебелер 200 мс ичинде жеке тамчылардын (кызыл жана сары жебелер) жаңы тамчыга (кызгылт сары жебе) кошулушун көрсөтөт.Масштаб тилкеси = 20 мкм.e Жарыктын чачырашы (350 нмде) LLPS буферинде αS/pLK агрегациясы 500 mM NaCl же 10% 1,6-HD 25 μM αS кошулганга чейин жана андан кийин (N = 3 үлгү көчүрмөсү, орточо жана стандарттык четтөө да көрсөтүлгөн).f BF сүрөтү (жогорку) жана жарык чачыратуу анализи (350 нм, ылдыйда) αS / pLK агрегациясынын 25 μM αS боюнча αS көбөйүшү менен: pLK молярдык катышы (N = 3 үлгү көчүрмөсү, орточо жана стандарттык четтөө да көрсөтүлгөн).Масштаб тилкеси = 10 мкм.Бир сүрөттөгү масштабдуу тилке бир панелдеги бардык сүрөттөрдүн масштабын көрсөтөт.Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.
αS/pLK электростатикалык комплексинин конденсациясын байкоолорубуздун жана tau31 менен түз өз ара аракеттенүү аркылуу tau/РНК конденсатынын кардар молекуласы катары αSнин мурунку байкоолорубуздун негизинде, биз αS жана tau РНК жок болгон учурда эриткич менен бирге бөлүнүшү мүмкүн деп божомолдодук. конденсация.электростатикалык комплекстер аркылуу жана αS αS/Tau коацерваттарындагы склад белок болуп саналат (2e-сүрөттө tau зарядынын бөлүштүрүлүшүн караңыз).Биз LLPS буферинде 10 мкм αS жана 10 мкм Tau441 (тиешелүүлүгүнө жараша 1 мкм AF488-αS жана 1 мкм Atto647N-Tau камтыган) WF микроскопиясы менен көрүнүп тургандай, эки протеинди камтыган протеин агрегаттарын оңой түзүшкөнүн байкадык.(2а-сүрөт).Тамчылардагы эки белоктун коллокализациясы конфокалдык (CF) микроскопия менен тастыкталды (Кошумча 1а-сүрөт).Окшош жүрүм-турум декстран-70 агрегациялоочу агент катары колдонулганда байкалган (Кошумча 1c сүрөт).FITC менен белгиленген PEG же декстранды колдонуу менен, биз эки жыйноочу агент тең үлгүлөр боюнча бирдей бөлүштүрүлүп, бөлүнүүнү да, ассоциацияны да көрсөтпөгөнүн таптык (Кошумча сүрөт 1d).Тескерисинче, бул системада алар макромолекулярдык топтоо эффектилери аркылуу фазаны бөлүүгө көмөктөшөт, анткени PEG башка LLP системаларында33,34 көрүнүп тургандай, артыкчылыктуу туруктуу жыйноочу агент болуп саналат.Бул протеинге бай тамчылар NaCl (1 M) үчүн сезгич болгон, бирок 1,6-HD (10% в/в) эмес, алардын электростатикалык касиеттерин тастыктаган (Кошумча сүрөт 2a, b).Алардын суюктук жүрүм-туруму BF микроскопия (сүрөт. 2b) колдонуу менен миллисекунд бириктирүү тамчы окуяларды байкоо менен тастыкталган.
LLPS буфериндеги αS/Tau441 коасерваттарынын конфокалдык (CF) микроскопиялык сүрөттөрү (ар бир белоктун 10 мкм, AF488 менен белгиленген αS жана Atto647N менен белгиленген Tau441дин 0,5 мкм).б αS/Tau441 тамчыларынын биригүү окуяларынын (ар бир белок үчүн 10 мкм) өкүлү дифференциалдык интерференция контрастын (DIC) сүрөттөрү.c Фаза диаграммасы Tau441 LLPS (0–15 μM) 50 мкМ αS жок (солдо) же бар (оңдо) болгон жарыктын чачырашына (350 нмде) негизделген.Жылуураак түстөр көбүрөөк чачыранды көрсөтөт.d αS/Tau441 LLPS үлгүлөрүнүн αS концентрациясынын көбөйүшү менен жарык чачырашы (5 μMде Tau441, N = 2–3 үлгүнүн кайталанышы көрсөтүлгөндөй).e Бул изилдөөдө колдонулган кээ бир тау протеининин варианттарынын жана протеиндин ар кандай аймактарынын схемалык сүрөттөлүшү: терс заряддуу N-терминалдык домен (кызыл), пролинге бай аймак (көк), микротүтүкчөлөрдү байланыштыруучу домен (MTBD, кызгылт сары менен белгиленген) жана амилоидди түзүүчү жуп спираль.MTBD (боз) ичинде жайгашкан жип аймактары (PHF).Tau441дин таза заряды (NCPR) картасы көрсөтүлгөн.f 1 μM AF488-белгиленген αS жана Atto647N-белгиленген ΔNt-, ΔNt-Tau (жогорку, ар бир протеинге 10 μM) же K18 (төмөнкү, ар бир μM5 протеин) катышуусунда 1 μM AF488-белгиленген αS же ΔCt-αS колдонуу ))) LLPS же K18 буферинде конденсацияланган WF микросүрөттөрү.Бир сүрөттөгү масштабдуу тилкелер бир панелдеги бардык сүрөттөрдүн масштабын билдирет (а, b жана f панелдер үчүн 20 мкм).c жана d панелдеринин чийки дайындары чийки маалымат файлдары катары берилет.
Бул LLPS жараянында αS ролун текшерүү үчүн, биз адегенде NaCl концентрациясын жогорулатуу аркылуу nephelometry аркылуу тамчы туруктуулугуна αS таасирин изилдедик (сүрөт. 2c).αS камтыган үлгүлөрдөгү туз концентрациясы канчалык жогору болсо, жарыктын чачырандылык маанилери ошончолук жогору болот (350 нм), бул бул LLPS системасындагы αSтин турукташтыруучу ролун көрсөтөт.Окшош эффект αS концентрациясын (демек, αS: Tau441 катышы) болжол менен жогорулатуу аркылуу байкалат.Тау концентрациясына (5 мкМ) салыштырмалуу 10 эсе көбөйөт (сүрөт 2d).αS коасерваттарда склад белок экенин көрсөтүү үчүн, биз ΔNt-Tau деп аталган терс заряддуу N-терминалдык аймагы (калдыктар 1-150, 2e сүрөтүн караңыз) жок LLPS-бузулган Тау мутантынын жүрүм-турумун иликтөөнү чечтик.WF микроскопиясы жана нефелометриясы ΔNt-Tau өзү LLPSке кабылбаганын тастыктады (2f-сүрөт жана кошумча сүрөт 2d), мурда билдирилгендей 14. Бирок, αS бул кыскартылган Tau вариантынын дисперсиялык эритмелерине кошулганда, LLPS процесси толугу менен болгон. окшош шарттарда жана протеин концентрациясында Tau жана αS толук өлчөмдөгү эритмелеринин тамчы тыгыздыгына жакын тамчы тыгыздыгы менен калыбына келтирилген.Бул процессти макромолекулярдык толтуруунун төмөн шарттарында да байкоого болот (Кошумча 2c сүрөт).С-терминалынын αS аймагынын ролу, бирок анын бүткүл узундугу эмес, LLPS процессиндеги (ΔCt - αS) белок (2f-сүрөт жана кошумча 2d-сүрөт).αS жана ΔNt-Tau коллокализациясы конфокалдык флуоресценттик микроскопия менен тастыкталды (Кошумча 1б-сүрөт).
Tau441 жана αS ортосундагы LLPS механизмин андан ары сынап көрүү үчүн кошумча Tau варианты колдонулган, атап айтканда, микротүтүкчөлөрдү бириктирүүчү домендеги (MTBD) жупташкан спираль жип өзөк (PHF) фрагменти, эгерде ал төрт мүнөздүү кайталануучу доменди камтыса, жалпыга белгилүү K18 фрагменти катары (2е-сүрөттү караңыз).Жакында αS пролинге бай доменде жайгашкан тау протеинине микротүтүкчөлөрдү байланыштыруучу домендин алдында турган ырааттуулукта байланышат деп кабарланды.Бирок, PHF аймагы оң заряддалган калдыктарга да бай (2e-сүрөттү караңыз), өзгөчө лизин (15% калдыктар), бул бизди бул аймак αS/Tau комплексинин конденсацияланышына да салым кошоорун текшерүүгө түрткү берди.Биз K18 жалгыз сыналган шарттарда LLPS 100 μM чейин концентрациясында ишке мүмкүн эмес экенин байкадык (15% PEG же 20% декстран менен LLPS буфер) (Figure 2f).Бирок, биз 50 μM αS 50 μM K18ге кошкондо, K18 жана αS камтыган белок тамчыларынын тез пайда болушу нефелометрия (Кошумча 2d сүрөт) жана WF микроскопиясы (2f-сүрөт) аркылуу байкалган.Күтүлгөндөй, ΔCt-αS K18дин LLPS жүрүм-турумун калыбына келтире алган жок (сүрөт 2f).αS/K18 агрегациясы αS/ΔNt-Tau же αS/Tau441ге салыштырмалуу LLPSти индукциялоо үчүн бир аз жогору белок концентрациясын талап кылаарын белгилейбиз, башка нерселер бирдей.Бул мурда 31 сүрөттөлгөндөй, microtubule-милдеттүү доменге салыштырмалуу пролин-бай Тау домен менен αS C-терминал аймактын күчтүү өз ара шайкеш келет.
ΔNt-Tau αS жок болгон учурда LLPSти аткара албастыгын эске алып, биз бул Tau вариантын толук узундуктагы Tau (изотип, Tau441/Tau441) менен LLPS тутумдарында анын жөнөкөйлүгүн эске алуу менен αS/Tau LLPS мүнөздөө үчүн үлгү катары тандадык.татаал (гетеротиптүү, αS/Tau441) агрегация процесстери менен.αS/Tau жана αS/ΔNt-Tau системаларындагы αS агрегациясынын даражасын (конденсацияланган фазалык белоктун бир бөлүгү катары, fαS,c) центрифугалоо жана дисперстүү фаза SDS-PAGE анализи аркылуу салыштырдык (2e караңыз), абдан окшош маанилерди таптык. бирдей концентрациядагы бардык белоктор үчүн.Атап айтканда, биз αS/Tau жана αS/ΔNt-Tau үчүн fαS,c 84 ± 2% жана 79 ± 7% алдык, αS жана tau ортосундагы гетеротиптүү өз ара аракеттенүү tau молекулаларынын өз ара аракеттенүүсүнөн жогору экенин көрсөтүп турат.ортосунда.
Ар кандай поликатиондор менен өз ара аракеттешүүсү жана конденсация процессинин αS кинетикасына тийгизген таасири алгач photobleaching (FRAP) ыкмасынан кийин флуоресценцияны калыбына келтирүү менен изилденген.Биз αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau жана αS/pLK коасерваттарын сынап көрдүк (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS жана 100 μM Tau441 же ΔNt-Tau же 1 mM pLK менен толукталган).Маалыматтар үлгү компоненттерин аралаштыргандан кийин биринчи 30 мүнөттүн ичинде алынган.Өкүл FRAP сүрөттөрүнөн (3a-сүрөт, αS/Tau441 конденсациясы) жана алардын тиешелүү убакыт курсунун ийри сызыктарынан (3b-сүрөт, кошумча сүрөт 3), αS кинетикасынын Tau441 коацерваттарына абдан окшош экенин көрүүгө болот.жана ΔNt-Tau, бул pLK менен тезирээк.FRAP боюнча коасерваттын ичиндеги αS үчүн эсептелген диффузия коэффициенттери (Kang ж.б. 35 сүрөттөгөн) D = 0,013 ± 0,009 мкм2/с жана αS/Tau441 жана α-S/Δt үчүн D = 0,026 ± 0,008 мкм2/с. αS/ системасы.pLK, Tau жана D = 0,18 ± 0,04 μm2/s, тиешелүүлүгүнө жараша (сүрөт 3c).Бирок, дисперстик фазадагы диффузия коэффициенти αS бардык конденсацияланган фазалардан бир нече даражага жогору, Флуоресценттик корреляция спектроскопиясы (FCS, 3-сүрөттү караңыз) бирдей шарттарда (LLPS буфери), бирок поликатиондор жокто аныкталгандай. (D = 8 ± 4 мкм2/с).Демек, αS которуунун кинетикасы коацерваттарда дисперстүү фазадагы белокторго салыштырмалуу ачык молекулярдык кроссинг эффекттеринен улам бир топ азаят, бирок бардык коацерваттар пайда болгондон кийин биринчи жарым сааттын ичинде суюктукка окшош касиеттерин сактап калышат, тау фазасынан айырмаланып.pLK конденсатындагы ылдамыраак кинетика.
a–c FRAP анализи αS динамикасынын (2% AF488-белгиленген αS) электростатикалык коасерваттарда.αS/Tau441 FRAP анализдеринин үч нускадагы репрезентативдик сүрөттөрү (a) көрсөтүлгөн, мында кызыл чөйрөлөр түссүздөгөн жерлерди көрсөтүп турат.Масштаб тилкеси 5 микрон.b Орточо FRAP ийри сызыктары жана (c) 100 μM αS жана Tau441 (кызыл) же ΔNt-Tau (көк) же pLK (жашыл) эквимолярдык концентрацияларын колдонгон үч эксперименттен алынган 5-6 (N) ар кандай тамчылар үчүн эсептелген диффузия коэффициенттери (D) LLPS концентрациясын он эселенген.FRAP ийри сызыгынын стандарттык четтөөсү көлөкө түстө көрсөтүлгөн.Салыштыруу үчүн, дисперстүү фазадагы диффузия коэффициенти αS флуоресценттик корреляциялык спектроскопияны (FCS) колдонуу менен үч нускада аныкталган (кошумча маалымат үчүн 3-сүрөттү жана методдорду караңыз).d Эч кандай поликациясыз (кара) же 100 μM Tau441 (кызыл) же ΔNt-Tau (көк) же 1 mM pLK (жашыл) катышуусунда LLPS буфериндеги 100 μM TEMPOL-122-αS үзгүлтүксүз X диапазонундагы EPR спектрлери.Кыстарма эң кескин өзгөрүүлөр болгон күчтүү талаа сызыктарынын чоңойтулган көрүнүшүн көрсөтөт.50 μM TEMPOL-122-αS LLPS жок болгон учурда ар кандай поликатиондор менен байланыштыруучу ийри сызыктар (ПЕГ жок).Нормалдаштырылган EPR спектринин II (IIII/III) тилкеси менен салыштырганда III тилкесинин кыскарган амплитудасы Tau441 (кызыл), ΔNt-Tau (көк) жана pLK (жашыл) молярдык катышын жогорулатат.Түстүү сызыктар ар бир ийри сызыкта n окшош жана көз карандысыз байланыштыруучу участоктору бар орой байланыш моделин колдонуу менен маалыматтарга ылайыктуулугун көрсөтөт.Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.
Кошумча катары, биз багытталган айлануу белгилөө (SDSL) жана үзгүлтүксүз электрондук парамагниттик резонанс (CW-EPR) колдонуу менен ар кандай коацерваттарда αS динамикасын изилдедик.Бул ыкма IDPдин ийкемдүүлүгүн жана динамикасын реалдуу калдык резолюция менен билдирүүдө абдан пайдалуу экендигин далилдеди36,37,38.Бул максатта, биз бир Cys мутанттарында цистеиндин калдыктарын түздүк жана 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) спиндик зондун колдондук.Maleimid туундулары аларды белгилөө.Тагыраак айтканда, биз TEMPOL зонддорун 122 же 24 αS абалына киргиздик (TEMPOL-122-αS жана TEMPOL-24-αS).Биринчи учурда, биз поликатиондор менен өз ара аракеттенүүгө катышкан белоктун С-терминал аймагын көздөйбүз.Анын ордуна 24-позиция конденсаттагы белоктордун жалпы динамикасы жөнүндө маалымат бере алат.Эки учурда тең дисперстүү фазадагы белоктор үчүн алынган EPR сигналдары тез кыймылдуу абалдагы нитроксиддик радикалдарга туура келген.Tau же pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 же ΔNt-Tau 1:1 катышында же pLK 1:10 катышында) катышуусунда фазалык бөлүнүүдөн кийин салыштырмалуу жогорку интенсивдүүлүктүн өсүшү байкалган. αSнын EPR спектри.Жоготуу сызыгы кеңейип, суюлтулган фазадагы протеинге салыштырмалуу тамчылардагы αS ориентациясынын кинетикасынын азайгандыгын көрсөтүп турат (3d-сүрөт, Кошумча 4a-сүрөт).Бул өзгөрүүлөр 122-позицияда көбүрөөк байкалат. 24-позицияда pLK болушу зонддун кинетикасына таасир этпесе, 122-позицияда спектралдык сызык формасы олуттуу өзгөргөн (Кошумча 4а-сүрөт).Биз эки αS/поликация тутумунун 122-позициясындагы спектрлерди спин менен белгиленген IDP38,39 динамикасын сүрөттөө үчүн колдонулган изотроптук моделди (Кошумча 5а сүрөт) колдонуу менен моделдееге аракет кылганыбызда, эксперименталдык спектрлерди кайра түзө албадык..24 спиндик контрасттын абалын спектрдик симуляциялоо (Кошумча 5а сүрөт).Бул поликатиондордун катышуусунда αS С-терминал аймагынын спиндик конфигурацияларынын мейкиндигинде артыкчылыктуу позициялар бар экенин көрсөтүп турат.Эксперименттик EPR шарттарында конденсацияланган фазадагы αS үлүшүн эске алууда (84 ± 2%, 79 ± 7% жана αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau жана αS/pLK үчүн тиешелүүлүгүнө жараша 47 ± 4% — Кошумчаны караңыз Маалыматтарды анализдөөнүн 2e сүрөтү с), EPR ыкмасы менен аныкталган кеңейүү негизинен αSтин С-терминал аймагынын конденсацияланган фазадагы ар кандай поликатиондор менен өз ара аракеттенүүсүн чагылдыраарын көрүүгө болот (TEMPOL-122- колдонуудагы негизги өзгөрүү). αS) жана белоктун конденсациясы эмес.Зонддо микровискоздуктун жогорулашы байкалат.Күтүлгөндөй, аралашмага 1 M NaCl кошулганда, LLPSден башка шарттарда белоктун EPR спектри толугу менен калыбына келтирилген (Кошумча 4б-сүрөт).Жалпысынан алганда, биздин маалыматтар CW-EPR тарабынан аныкталган өзгөрүүлөр негизинен αS C-терминал аймагынын конденсацияланган фазадагы ар кандай поликатиондор менен өз ара аракеттенүүсүн чагылдырат жана бул өз ара аракеттенүү Tau менен караганда pLK менен күчтүүрөөк көрүнөт.
Коацерваттагы белоктор жөнүндө көбүрөөк структуралык маалымат алуу үчүн, биз эритмедеги NMRди колдонуу менен LLPS системасын изилдөөнү чечтик.Бирок, биз дисперстүү фазада калган αS фракциясын гана аныктай алдык, бул коацерваттын ичиндеги протеин динамикасынын азайышына жана ЯМР анализинде эритменин түбүндөгү жыш фазага байланыштуу болушу мүмкүн.LLPS үлгүсүнүн дисперстүү фазасында калган протеиндин структурасын жана динамикасын NMR (Кошумча сүрөт 5c, d) аркылуу талдап чыкканда, биз протеин pLK жана ΔNt-Tau катышуусунда дээрлик бирдей болгонун байкадык. белок омурткасынын экинчилик структурасында жана динамикасында болгон, экинчилик химиялык жылыш жана R1ρ релаксация боюнча эксперименттерде аныкталган.ЯМР маалыматтары көрсөткөндөй, αSтин С-терминусу поликатиондор менен өз ара аракеттенүүсүнөн улам башка белок ырааттуулугу сыяктуу бузулган табиятын сактап калуу менен конформациялык ийкемдүүлүктөн олуттуу жоготууга учурайт.
TEMPOL-122-αS конденсацияланган фазасында байкалган CW-EPR сигналынын кеңейиши белоктун поликатиондор менен өз ара аракеттенүүсүн чагылдыргандыктан, биз LLPS жок болгон шартта αSтин ар кандай поликатиондорго байланышуу жакындыгын баалоо үчүн EPR титрлөөсүн жүргүздүк. Buffer LLPS), суюлтулган жана концентрацияланган фазаларда өз ара аракеттешүү бирдей экенин сунуштайт (бул биздин маалыматтар менен тастыкталган, Кошумча 4a жана Кошумча 6-сүрөт).Максаты, бардык коацерваттар, алардын жалпы суюктук сыяктуу касиеттерине карабастан, молекулярдык деңгээлде кандайдыр бир негизги дифференциалдык жүрүм-турумду көрсөтүшүн билүү болгон.Күтүлгөндөй, EPR спектри поликатиондук концентрациясынын көбөйүшү менен кеңейип, молекулярдык ийкемдүүлүктүн бардык өз ара аракеттенүү өнөктөштөрүнүн молекулярдык өз ара аракеттенүүсүнүн дээрлик каныкканга чейин төмөндөшүн чагылдырган (сүрөт 3e, Кошумча 6-сүрөт).pLK бул каныктырууга ΔNt-Tau жана Tau441ге салыштырмалуу төмөнкү молярдык катышта (поликация: αS) жетишти.Чынында, болжолдуу байланыш модели менен маалыматтарды салыштыруу n окшош жана көз карандысыз байланыш сайттары pLK (~ 5 μM) көрүнүп турган диссоциация константы Tau441 же ΔNt-Tau (~ 50 μM) караганда төмөн бир тартип экенин көрсөттү. ).µM).Бул болжолдуу баа болсо да, бул αS үзгүлтүксүз оң заряд аймактары бар жөнөкөй поликатиондорго көбүрөөк жакындыгын көрсөтүп турат.αS жана ар кандай поликациялардын ортосундагы жакындыктын бул айырмасын эске алуу менен, биз алардын суюктук касиеттери убакыттын өтүшү менен ар кандай өзгөрүшү мүмкүн жана ошентип, ар кандай LSPT процесстеринен жапа чегиши мүмкүн деп божомолдодук.
Белоктун коацерватынын ичиндеги өтө жыш чөйрөнү жана протеиндин амилоиддик табиятын эске алуу менен, биз мүмкүн болгон LSPT процесстерин аныктоо үчүн убакыттын өтүшү менен коацерваттын жүрүм-турумун байкадык.BF жана CF микроскопиясын колдонуу менен (4-сүрөт), биз αS/Tau441 эритмеде көп өлчөмдө коасерватка айланып, кудуктун/слайддын түбүндөгү бетке тийип, нымдап турган чоң тамчыларды түзөрүн байкадык, күтүлгөндөй (Кошумча сүрөт 1). 7d);түбүндө пайда болгон бул түзүлүштөрдү биз «белок салдары» деп атайбыз.Бул структуралар суюк бойдон калууда, анткени алар биригүү жөндөмүн сактап калышты (Кошумча 7b-сүрөт) жана LLPS иштетилгенден кийин бир нече саат бою көрүүгө болот (4-сүрөт жана Кошумча сүрөт 7c).Биз нымдоо процесси гидрофобдук эмес материалдардын бетинде (Кошумча 7а-сүрөт), теңдешсиз заряды бар электростатикалык коацерваттар үчүн күтүлгөндөй, ошондой эле электростатикалык беттик потенциалы жогору экенин байкадык.Белгилей кетчү нерсе, αS/ΔNt-Tau биригүүсү жана рафтинг кыйла кыскарган, ал эми αS/pLK конденсаттары кыйла кыскарган (4-сүрөт).Кыска инкубациялоо убактысынын ичинде αS/pLK тамчылары биригип, гидрофиликтүү бетти нымдай алышты, бирок бул процесс тез эле токтоп, 5 сааттык инкубациядан кийин чектелген гана коалесценция окуялары жана нымдоо байкалган жок.– гель-тамчылатма өтүү.
LLPS буферинде 100 мкМ αS (1% флуоресценттик энбелги) камтыган коацерват үлгүлөрүнүн 100 μM Tau441 (жогорку) микроскопиялык сүрөттөр)ΔN катышуусунда BF (боз түстүү панелдер) жана CF (оң панелдер, AF488 менен белгиленген αS жашыл түстө) -Tau (ортодо) же 1 mM pLK (төмөндө) ар кандай инкубация убакыттарында жана фокалдык бийиктикте (z, пластинанын түбүнөн алыстыкта).Тажрыйбалар бирдей натыйжалар менен бири-биринен көз карандысыз 4-6 жолу кайталанды.αS/Tau441 коасерваттары 24 сааттан кийин нымдап, сүрөттөн чоңураак салдарды түзөт.Бардык сүрөттөр үчүн масштаб тилкеси 20 микрон.
Андан кийин биз αS/Tau441 LLPSде пайда болгон чоң суюктук сымал протеин көлмөлөрү изилденген протеиндердин кайсынысынын амилоиддик агрегациясына алып келерин сурадык.Биз жогорудагыдай шарттарда WF микроскопиясы менен αS/Tau441 тамчыларынын жетилишин ээрчтик, бирок 1 μM AF488-белгиленген αS жана Atto647N-белгиленген Tau441 (сүрөт 5a).Күтүлгөндөй, биз жетилүү процессинде протеиндин толук локализациясын байкадык.Кызыктуусу, болжол менен.5 сааттан кийин салдардын ичинде биз «чекит» деп атаган интенсивдүү тегерек эмес структуралар байкалган, алардын кээ бирлери αS менен колокализацияланган, кээ бирлери Tau441 менен байыган (5а-сүрөт, ак жебелер).Бул тактар ​​αS/ΔNt-Tauга караганда αS/ΔNt-Tau үчүн көбүрөөк салдардын ичинде байкалган.pLK жана Tau системаларынын тамчыларында биригүү/нымдоо үчүн жөндөмсүз так тактар ​​болгон эмес.αS жана Tau441 камтыган бул тактар ​​амилоид сымал агрегаттар экендигин текшерүү үчүн биз CF микроскопиясын колдонуп, окшош эксперимент жүргүздүк, анда Tau441 Atto647N менен белгиленген жана 12,5 мкМ амилоидге тиешелүү тиофлавин-Т (ThT) башынан эле кошулган.боёк.αS/Tau441 тамчыларынын же салдардын ThT боёгу инкубациядан 24 саат өткөндөн кийин да байкалбаса да (сүрөт 5b, үстүнкү катарда - белок салдардын үстүндө калган тамчылар), салдардын ичинде Atto647N-Tau441 камтыган ThT-оң структуралар абдан начар болгон.бул мурда сүрөттөлгөн тактардын өлчөмүн, формасын жана жайгашкан жерин кайталайт (сүрөт 5b, ортоңку жана төмөнкү катар), бул тактар ​​карыган суюктук коацерваттарында пайда болгон амилоид сымал агрегаттарга туура келиши мүмкүн деп болжолдойт.
WF 25 μM αS ар кандай инкубация убакыттарында жана фокалдык бийиктиктерде (z, чектелбеген түбүнөн аралык) LLPS буфери бар микроскоп пластинкасынын кудугунда 25 μM Tau441 (1 μM AF488 менен белгиленген αS жана Atto647N менен белгиленген Tau441) катышуусунда) .Алты эксперименттер окшош натыйжалар менен өз алдынча кайталанган.25 мкм Tau441 (1 мкм Atto647N-белгиленген Tau441) жана 12,5 мкм thioflavin-T (ThT) катышуусунда 25 мкм αS б CF микроскопиялык сүрөтү.Салмактуу протеин тамчылары жана сакталган белок салдары жана тактары, тиешелүүлүгүнө жараша, жогорку жана ортоңку катарларда көрсөтүлгөн.Төмөнкү сапта 3 көз карандысыз репликациядан салдардын жана тамчылардын сүрөттөрү көрсөтүлгөн.Ак жебелер эки панелде тең ThT-позитивдүү чекиттерди көрсөтөт.Бардык сүрөттөр үчүн масштаб тилкеси 20 микрон.
Суюктуктан катууга өтүү учурунда коацерват протеин тармагындагы өзгөрүүлөрдү кененирээк изилдөө үчүн биз флуоресценттик өмүр бою сүрөттөө (FLIM) жана Фёрстер-резонанстык энергияны өткөрүү микроскопиясын (FRET) колдондук (6-сүрөт жана кошумча 8 жана 9-сүрөттөр).Биз катмардын бир кыйла конденсацияланган же ал тургай катуу окшош агрегацияланган протеин структурасына айланган коасерваттык жетилиши протеин менен ага туташтырылган флуоресценттик зонддун ортосунда тыгыз байланышка алып келет, бул протеиндин кыскартылган иштөө мөөнөтүндө (τ) көрүнгөн өчүрүү эффектин пайда кылат деп гипотеза жасадык. , мурда айтылгандай40.,41 ,42.Кошумчалай кетсек, кош белгиленген үлгүлөр үчүн (AF488 жана Atto647N, тиешелүүлүгүнө жараша, FRET донору жана акцептордук боёктор катары), τ бул төмөндөшү да коасерват конденсациясы жана LSPT учурунда FRET (E) эффективдүүлүгүнүн жогорулашы менен коштолушу мүмкүн.Биз LLPS αS/Tau441 жана αS/ΔNt-Tau үлгүлөрүндө убакыттын өтүшү менен салдардын жана тактардын пайда болушуна мониторинг жүргүздүк (LLPS буфериндеги ар бир протеиндин 25 мкм αS жана/же Tau441 же ΔNt-Tau деп белгиленген αS жана/же Atto647N менен белгиленген 1 μM AF488 камтыган).Биз жалпы тенденцияны байкадык, AF488 (τ488) жана Atto647N (τ647N) зонддорунун флуоресценциянын иштөө мөөнөтү коацерваттар жетилген сайын бир аз кыскарды (6-сүрөт жана кошумча сүрөт 8c).Кызыктуусу, бул өзгөрүү салдардагы чекиттер үчүн кыйла жакшырды (сүрөт 6c), бул андан ары белок конденсациясы чекиттерде болгонун көрсөтүп турат.Муну колдоо үчүн, 24 саат бою карыган αS/ΔNt-Tau тамчылары үчүн флуоресценциянын өмүрүндө олуттуу өзгөрүү байкалган жок (Кошумча 8d-сүрөт), бул тамчылардын гелиациясы тактардан айырмаланган процесс жана ал олуттуу молекулярдык кайра түзүлүү менен коштолбойт деп болжолдойт. коасерваттардын ичинде.Белгилей кетчү нерсе, чекиттер αSда, өзгөчө αS/Tau441 системасы үчүн ар кандай өлчөмдө жана өзгөрүлмө мазмунга ээ (Кошумча сүрөт 8e).Спец флуоресценциянын иштөө мөөнөтүнүн кыскарышы, айрыкча Tau441 деп белгиленген Atto647N үчүн интенсивдүүлүктүн көбөйүшү менен коштолду (Кошумча сүрөт 8a) жана αS/Tau441 жана αS/ΔNt-Tau системалары үчүн дагы FRET эффективдүүлүгү, LLPS ичинде беш сааттык конденсацияны көрсөтүп турат. кыймылга келтиргенден кийин статикалык электрдин ичиндеги белоктор конденсацияланат.αS/ΔNt-Tau менен салыштырганда, биз αS/Tau441 тактарында τ647N төмөн жана бир аз жогору τ488 маанилерин байкадык, алар төмөнкү жана бир тектүү эмес FRET маанилери менен коштолду.Мүмкүн, бул αS/Tau441 тутумунда агрегаттардагы байкалган жана күтүлгөн αS көптүгү Tauга салыштырмалуу көбүрөөк гетерогендүү, көбүнчө субстоихиометриялык болгондугу менен байланыштуу болушу мүмкүн, анткени Tau441 өзү да LLPS жана агрегацияга дуушар болушу мүмкүн (Кошумча 8e сүрөт) .Бирок, суюктук сымал коацерваттардын ичиндеги тамчылардын биригүүсү, салдын пайда болушу жана эң негизгиси белоктун агрегациясынын даражасы Tau441 жана αS экөө тең болгондо максималдуу болот.
αS/Tau441 жана αS/ΔNt-Tau ар бир протеиндин 25 мкм (1 мкм AF488 менен белгиленген αS жана 1 мкм Atto647N менен белгиленген Tau441 же ΔNt-Tau) буфериндеги өмүр бою флуоресценттик микроскопиянын (FLIM) сүрөттөрү.Мамычалар LLPS үлгүлөрүнүн ар кандай жетилген убакыттарда (30 мин, 5 саат жана 24 саат) өкүлчүлүктүү сүрөттөрүн көрсөтөт.Кызыл рамка αS/Tau441 тактары бар аймакты көрсөтөт.Өмүрүнүн узактыгы түс тилкелери катары көрсөтүлгөн.Бардык сүрөттөр үчүн масштаб тилкеси = 20 мкм.b А панелиндеги кызыл кутуда көрсөтүлгөн тандалган аймактын чоңойтулган FLIM сүрөтү.Жашоо диапазондору a панелиндегидей түс шкаласынын жардамы менен көрсөтүлөт.Масштаб тилкеси = 5 мкм.c Tau441 жана αS- үчүн жазылган FLIM сүрөттөрүндө аныкталган ар кандай белок түрлөрү үчүн (тамчылар-D-, сал-R- жана тактар-P) AF488 (αSга тиркелген) же Atto647N (Тауга тиркелген) көрсөткөн гистограммалар αS/ΔNt-Tau коасерват үлгүлөрү (D үчүн N = 17-32 ROI, R үчүн 29-44 ROI жана упайлар үчүн 21-51 ROI).Орточо жана медианалык маанилер, тиешелүүлүгүнө жараша, кутучалардын ичинде сары чарчы жана кара сызыктар катары көрсөтүлгөн.Кутучанын төмөнкү жана жогорку чеги тиешелүүлүгүнө жараша биринчи жана үчүнчү квартилдерди билдирет, ал эми 1,5 эселенген квартиль аралык диапазондун (IQR) ичиндеги минималдуу жана максималдуу маанилер мурутчалар катары көрсөтүлгөн.Чектөөлөр кара бриллианттар катары көрсөтүлгөн.Бөлүштүрүү жуптарынын ортосундагы статистикалык маанилүүлүк бирдей эмес дисперсияларды кабыл алуу менен эки үлгүлүү t-тесттин жардамы менен аныкталган.Эки тараптуу t-тесттин p-маанилери салыштырылган маалыматтардын ар бир жуп үчүн жылдызчалар менен көрсөтүлөт (* p-маани > 0,01, ** p-маани > 0,001, *** p-маани > 0,0001, **** p-маани > 0,00001), ns Болбогондукту көрсөтөт (p-маани > 0,05).Так p маанилери 1-таблицада берилген жана баштапкы маалыматтар чийки маалымат файлдары катары берилген.
Тактардын/агрегаттардын амилоид сымал табиятын андан ары көрсөтүү үчүн, биз 24 саат бою (1 М) NaCl жогорку концентрациясы менен боёлбогон коацерват үлгүлөрүн иштеттик, анын натыйжасында агрегаттар белок коацерваттарынан бөлүнөт.Атомдук күч микроскопунун (AFM) жардамы менен изоляцияланган агрегаттар (б.а. агрегаттардын дисперстүү эритмеси) байкалганда, биз 15 нмге жакын нормалдуу бийиктиктеги негизинен сфералык морфологияны байкадык, ал туздун жогорку концентрациясынын шарттарында биригүүгө умтулат, үстүнкү күчтүү гидрофобдук таасирден улам типтүү амилоид фибрилдеринин жүрүм-туруму (фибрилдер адатта ~ 10 нм бийиктикке ээ экенин эске алыңыз) (Кошумча сүрөт 10а).Кызыктуусу, обочолонгон агрегаттар ThT менен стандарттык ThT флуоресценция анализинде инкубацияланганда, биз ThT флуоресценциясынын кванттык түшүмүнүн кескин көбөйгөнүн байкадык, бул боёк типтүү αS амилоид фибрилдери менен инкубацияланганда байкалганга окшош (Кошумча сүрөт 10b), коацерват агрегаттары амилоид сымал структураларды камтыйт..Чынында, агрегаттар туздун жогорку концентрациясына чыдамдуу болгон, бирок типтүү амилоид фибрилдери сыяктуу 4 М гуанидин хлоридине (GdnHCl) сезгич болгон (Кошумча 10c сүрөт).
Андан кийин, биз бир молекулалык флуоресценцияны, спецификалык флуоресценттик корреляцияны/кайчылаш-корреляциялык спектроскопияны (FCS/FCS) жана эки түстүү кокустуктарды аныктоонун (TCCD) жарылуу анализин колдонуу менен агрегаттардын курамын талдадык.Бул максатта, биз αS жана Tau441 (экөө тең 25 мкм) камтыган 100 мкл LLPS үлгүлөрүндө 24 саат инкубациялоодон кийин түзүлгөн агрегаттарды 1 μM AF488 менен белгиленген αS жана 1 μM Atto647N менен белгиленген Tau441 менен бөлүп алдык.LLPS жана протеиндин ортосундагы мүмкүн болгон электростатикалык өз ара аракеттенүүнүн алдын алуу үчүн, ошол эле PEG-эркин буферди жана 1 M NaCl (ошол эле буферди коасерваттан агрегаттарды бөлүү үчүн колдонулат) колдонуп мономолекулярдык абалга келтирилген дисперстүү агрегаттык эритмени суюлтуңуз.Бир молекуланын убакыт траекториясынын мисалын 7а-сүрөттө көрүүгө болот.FCCS/FCS анализи (кайчылаш-корреляция, CC жана автокорреляция, AC) үлгүлөрдө αS жана tau камтыган агрегаттар көп экенин көрсөттү (7b-сүрөттөгү CC ийри сызыгын караңыз, сол панель) жана мономердик протеиндин калдыктары ашыкча пайда болгон. суюлтуу процессинин натыйжасы (7b-сүрөттөгү AC ийри сызыктарын караңыз, сол панель).Монмердик протеиндерди камтыган үлгүлөрдү колдонуу менен бирдей эритменин шарттарында жүргүзүлгөн контролдук эксперименттер CC ийри сызыктарын көрсөткөн жок, ал эми AC ийри сызыктары бир компоненттүү диффузиянын моделине (4-теңге) жакшы туура келет, мында мономердик белоктор күтүлгөн диффузиялык коэффициенттерге ээ (сүр. 7b). ), оң панел).Агрегацияланган бөлүкчөлөрдүн диффузия коэффициенти 1 мкм2/с кем, ал эми мономердик белоктордуку болжол менен 1 мкм2/с.50–100 мкм/с;баалуулуктар αS амилоид фибрилдери жана мономердик αS үчүн буга чейин жарыяланган маанилерге окшош, ошондой эле чечимдин окшош шарттарында өзүнчө 44.Биз агрегаттарды TCCD жарылуу анализи менен талдаганыбызда (сүр. 7c, үстүнкү панель), биз ар бир изоляцияланган агрегатта (αS/Tau гетероагрегаты) табылган агрегаттардын 60%га жакынында αS жана tau да, 30%га жакыны гана камтылганын таптык. tau, болжол менен 10% αS гана.αS/Tau гетероагрегаттарынын стехиометриялык талдоосу гетероагрегаттардын көбү тау менен байытылганын көрсөттү (стехиометрия 0,5тен төмөн, бир агрегаттагы tau молекулаларынын орточо саны αS молекулаларынан 4 эсе көп), бул биздин FLIMде байкалган ишибизге дал келет. эксперименттер..FRET анализи көрсөткөндөй, бул агрегаттарда эки протеин тең бар, бирок бул учурда FRETдин чыныгы маанилери чоң мааниге ээ эмес, анткени ар бир агрегатта флюорофорлордун бөлүштүрүлүшү экспериментте колдонулган белгиленбеген белоктун ашыкча болушунан улам кокустук болгон.Кызыктуусу, биз ошол эле анализди 45,46 жетилген амилоид агрегациясынын жетишсиз Тау вариантын колдонгондо (Кошумча 11a, b-сүрөттү караңыз), αS электростатикалык агрегация бирдей болгонуна карабастан (Кошумча 11c, d), коацерваттын ичинде агрегаттарды түзүү жөндөмдүүлүгү кескин кыскарган жана FLIM in situ эксперименттеринде бир нече тактарды аныктаган жана обочолонгон агрегат үлгүлөрү үчүн алсыз кайчылаш корреляция ийри сызыктары байкалган.Бирок, аз сандагы аныкталган агрегаттар үчүн (Tau441нин ондон бири гана) биз ар бир агрегаттын бул Tau вариантына караганда αS менен байытылганын байкадык, аныкталган агрегаттардын болжол менен 50% αS молекулаларын гана камтыган жана αS ашыкча гетерогендүү болгон. .агрегаттар (Кошумча 11e-сүрөттү караңыз), Tau441 тарабынан түзүлгөн гетерогендүү агрегаттардан айырмаланып (6f-сүрөт).Бул эксперименттердин натыйжалары αS өзү коацерваттын ичинде tau менен топтолууга жөндөмдүү болсо да, бул шарттарда тау нуклеациясы жагымдуураак жана пайда болгон амилоид сымал агрегаттар αS жана tau формасы катары аракеттене аларын көрсөттү.Бирок, tau-бай өзөк пайда болгондон кийин, αS жана tau ортосундагы гетеротиптүү өз ара аракеттешүү, tau молекулаларынын ортосундагы гомотиптүү өз ара аракеттешүүлөргө караганда агрегаттарда артыкчылыкка ээ болот;биз ошондой эле суюк αS/tau коацерваттарында белок тармактарын байкайбыз.
αS/Tau441 электростатикалык коацерваттарда түзүлгөн изоляцияланган агрегаттардын бирдиктүү молекулаларынын репрезентативдик флуоресценттик убактылуу издери.αS/Tau441 коагрегаттарына туура келген жарылуулар (көрсөтүлгөн босогодон жогору жарылуулар) үч аныктоо каналында байкалды (түз дүүлүккөндөн кийин AF488 жана Atto647N эмиссиясы, көк жана кызыл сызыктар, кыйыр дүүлүккөндөн кийинки Atto647N эмиссиясы), FRET, кызгылт көк сызык).b LLPSтен алынган изоляцияланган αS/Tau441 агрегаттарынын үлгүсүн FCS/FCCS талдоо (сол панель).AF488 жана Atto647N үчүн автокорреляция (AC) ийри сызыктары тиешелүүлүгүнө жараша көк жана кызыл түстө, ал эми эки боёкту камтыган агрегаттар менен байланышкан кайчылаш корреляция (CC) ийри сызыктары кызгылт көк түстө көрсөтүлгөн.AC ийри сызыктары маркаланган мономердик жана агрегацияланган белок түрлөрүнүн болушун чагылдырат, ал эми CC ийри сызыктары кош белгиленген агрегаттардын диффузиясын гана көрсөтөт.Ошол эле талдоо, бирок обочолонгон тактардагыдай эле чечим шарттарында мономердик αS жана Tau441 гана камтыган үлгүлөр оң панелде башкаруу элементтери катары көрсөтүлгөн.c αS/Tau441 электростатикалык коасерваттарда түзүлгөн изоляцияланган агрегаттардын бир молекулаларынын флуоресценттик жарк анализи.Төрт түрдүү кайталоодо табылган ар бир агрегат үчүн маалымат (N = 152) алардын стехиометриясына, S маанилерине жана FRET эффективдүүлүгүнө (жогорку панель, түс тилкеси көрүнүштү чагылдырат).агрегаттардын үч түрүн айырмалоого болот: -αS - S~1 жана FRET~0 менен гана агрегаттар, S~0 жана FRET~1 менен Tau гана агрегаттар жана орто S жана FRET менен гетерогендүү Tau/αS агрегаттары. Ар бир гетерогендүү агрегатта (N = 100) табылган эки маркер протеининин тең көрсөткүчтөрү төмөнкү панелде көрсөтүлөт (түс шкаласы көрүнүштү чагылдырат).Чийки маалыматтар чийки маалымат файлдары түрүндө берилет.
Убакыттын өтүшү менен суюк протеин конденсаттарынын жетилиши же эскирип, гел сымал же катуу структураларга айлануусу конденсатты47 бир нече физиологиялык функцияларына, ошондой эле амилоиддик агрегацияга чейинки анормалдуу процесс катары ооруга катышат 7, 48, 49. Бул жерде фазаны бөлүүнү жана жүрүм-турумун майда-чүйдөсүнө чейин изилдейбиз.Төмөнкү микромолярдык концентрацияларда жана физиологиялык жактан актуалдуу шарттарда контролдонуучу чөйрөдө кокус поликациялар болгон учурда LSPT αS (αSнин эсептелген физиологиялык концентрациясы >1 μM50 экенин эске алыңыз), LPSтин типтүү термодинамикалык кыймыл-аракетинен кийин.Физиологиялык рНда өтө терс заряддуу С-терминал аймагын камтыган αS электростатикалык процесс аркылуу pLK же Tau сыяктуу жогорку катиондук тартипсиз пептиддердин катышуусунда LLPS аркылуу суудагы эритмеде протеинге бай тамчыларды түзө аларын аныктадык. агрегациялык макромолекулалардын катышуусунда татаал конденсация.Бул жараян αS in vitro жана in vivo 51,52,53,54 да, анын оору менен байланышкан агрегация менен байланышкан ар кандай polycationic молекулаларды жолуккан уюлдук чөйрөдө тиешелүү таасир этиши мүмкүн.
Көптөгөн изилдөөлөрдө, тамчылардын ичиндеги белок динамикасы жетилүү процессин аныктоочу негизги факторлордун бири катары каралат55,56.Поликатиондор менен электростатикалык αS коацерваттарында жетилүү процесси, сыягы, поликатиондор менен өз ара аракеттенүү күчүнө, валенттүүлүккө жана бул өз ара аракеттешүүлөрдүн көптүгүнө көз каранды.Тең салмактуулук теориясы эки суюк абалдын тең салмактуу ландшафтында LLPS57,58 кыймылдаткычы биополимерлерге бай чоң тамчынын болушун болжолдойт.Тамчылардын өсүшүнө Оствальд жетилүү59, биригүү60 же дисперстүү фазада эркин мономерди керектөө аркылуу жетишүүгө болот61.αS жана Tau441, ΔNt-Tau же pLK үчүн белоктун көбү бул изилдөөдө колдонулган шарттарда конденсатта топтолгон.Бирок, толук өлчөмдөгү тау тамчылары жер үстүндөгү нымдануу менен тез биригсе да, тамчылардын биригүүсү жана нымдоосу ΔNt-Tau жана pLK үчүн кыйын болгон, бул бул эки системада суюктук касиеттерин тез жоготууну сунуштайт.Биздин FLIM-FRET анализибизге ылайык, карыган pLK жана ΔNt-Tau тамчылары оригиналдуу тамчыларга окшош протеин агрегациясынын даражасын (окшош флуоресценциянын өмүрү) көрсөттү, бул баштапкы протеин тармагы катуураак болсо да, сакталып калганын билдирет.
Эксперименталдык натыйжаларыбызды төмөнкү моделде рационализациялайбыз (8-сүрөт).Башында убактылуу пайда болгон тамчылар көбүнчө электростатикалык компенсациясы жок белок тармактары болуп саналат, демек, заряддын дисбаланс аймактары бар, өзгөчө тамчылардын интерфейсинде, натыйжада электростатикалык беттик потенциалы жогору тамчылар пайда болот.Заряддын ордун толтуруу үчүн (бул кубулуш, адатта, валенттүүлүктүн азайышы деп аталат) жана тамчылардын беттик потенциалын минималдаштыруу үчүн, тамчылар суюлтулган фазадагы жаңы полипептиддерди камтышы, заряд-заряддын өз ара аракеттенүүсүн оптималдаштыруу үчүн белок тармактарын кайра уюштуруу жана башка тамчылар менен өз ара аракеттенүү.беттери менен (нымдоо).αS/pLK тамчылары жөнөкөй белок тармагы (αS менен pLK ортосундагы гетеротиптүү өз ара аракеттенүү) жана белок менен протеиндин өз ара аракеттенүүсүнө көбүрөөк жакындыгынан улам, конденсаттын зарядын тезирээк тең салмактай алат окшойт;чынында эле, биз алгач түзүлгөн αS/pLK коасерваттарында αS/Tauга караганда тезирээк белок кинетикасын байкадык.Валенттүүлүк азайгандан кийин, өз ара аракеттенүү азыраак эфемердик болуп, тамчылар суюктук касиетин жоготуп, электростатикалык беттик потенциалы төмөн (ошондуктан бетти нымдай албаган) гел сымал, күйбөгөн тамчыларга айланат.Ал эми, αS/Tau тамчылары татаал белок тармактарынын (гомотиптүү жана гетеротиптүү өз ара аракеттенүүсү менен) жана протеиндердин өз ара аракеттенүүсүнүн алсызыраак мүнөзүнөн улам, тамчы зарядынын балансын оптималдаштырууда азыраак эффективдүү.Бул суюктуктун жүрүм-турумун узак убакытка сактаган тамчыларга алып келет жана жогорку электростатикалык беттик потенциалды көрсөтөт, алар биригүү жана өсүү жолу менен (ошондуктан тамчылардын бетинин аянты/көлөмүнүн катышын минималдаштыруу) жана гидрофилдик беттин хим.Бул протеин тармагында зарядды оптималдаштыруу боюнча үзгүлтүксүз издөөнүн аркасында өз ара аракеттенүү өтө өткөөл бойдон калууда, бул суюктук касиеттерин сактап турган чоң концентрацияланган белок китепканаларын түзөт.Кызыктуусу, Таунун N-терминалдуу кесилген формалары, анын ичинде кээ бир табигый изоформалар62, ортодогу жүрүм-турумун көрсөтүшөт, кээ бир коацерваттар αS менен узакка созулган гел сымал тамчыларга, башкалары чоң суюк конденсаттарга айланат.αS электростатикалык коасерваттардын жетилишиндеги бул эки тараптуулук конденсаттын өлчөмүн жана суюктуктун касиеттерин көзөмөлдөөнүн ачкычы катары конденсаттарда валенттүүлүктүн азайышы менен электростатикалык сүзүүнүн ортосундагы корреляцияны аныктаган акыркы LLPS теориялык жана эксперименталдык изилдөөлөрүнө шайкеш келет.Механизм 58.61.
Бул схема LLPS жана LSPT аркылуу αS жана Tau441 үчүн болжолдуу амилоиддик агрегация жолун көрсөтөт.Кошумча анионго бай (кызыл) жана катионго бай (көк) аймактар ​​менен αS жана канааттандырарлык валенттүүлүктүү тау электростатикалык коасерваттар беттик энергияга ээ, демек, азыраак биригүүгө ээ, натыйжада тамчы тез картаюуга алып келет.Туруктуу агломерацияланбаган гел абалына жетишилет..Бул жагдай αS/pLK системасында абдан жагымдуу, анткени анын жогорку жакындыгы жана протеин-жуп ара аракеттенүү тармагынын жөнөкөйлүгү, гелге окшош тез өтүүгө мүмкүндүк берет.Тескерисинче, канааттандырарлык эмес валенттүү тамчылар жана демек, өз ара аракеттенүү үчүн жеткиликтүү белок заряддуу аймактар ​​коацерваттын жогорку беттик энергиясын азайтуу үчүн гидрофилдик бетти эритип, нымдоону жеңилдетет.Бул жагдай алсыз Тау-Тау жана αS-Тау өз ара аракеттенүүдөн турган көп валенттүү татаал тармакка ээ αS/Tau441 коасерваттары үчүн жакшыраак.Өз кезегинде, чоңураак коацерваттар суюктукка окшош касиеттерин тезирээк сактап калат, бул протеин-белоктун башка өз ара аракеттенүүсүнө жол ачат.Акыр-аягы, αS жана tau да камтыган амилоиддик гетерогендүү агрегаттар коацерват суюктугунун ичинде пайда болот, алар нейродегенеративдик оорулардын белгилери болуп саналган инклюзия денелеринде табылгандарга байланыштуу болушу мүмкүн.
αS/Tau441 жетилүү учурунда пайда болгон чоң суюктук сымал структуралар өтө тыгындуу, бирок динамикалык белок чөйрөсү жана азыраак даражада αS/ΔNt-Tau коацерваттары белоктун агрегациясынын ядролук түзүлүшү үчүн идеалдуу резервуар болуп саналат.Биз, чынында эле, белок коацерваттарынын бул түрүндөгү катуу белок агрегаттарынын пайда болушун байкадык, көбүнчө αS жана tau да камтылат.Биз бул гетероагрегаттар электростатикалык эмес өз ара аракеттешүү менен турукташканын, типтүү амилоид фибрилдериндей эле амилоиддик спецификалык ThT боёкторун байланыштыра аларын жана чындыгында ар кандай таасирлерге окшош туруктуулугун көрсөттүк.LLPS тарабынан түзүлгөн αS/tau агрегаттары амилоид сыяктуу касиеттерге ээ экени көрсөтүлгөн.Чынында эле, амилоиддик агрегацияда жетишсиз болгон Tau жетилген варианты суюк электростатикалык коасерваттын ичинде бул гетерогендүү αS агрегаттарынын пайда болушунда олуттуу түрдө бузулат.αS/Tau441 агрегаттарынын пайда болушу суюктукка окшош касиеттерин сактаган коацерваттардын ичинде гана байкалган жана коацерваттар/тамчылар гел абалына жетпесе, эч качан байкалган эмес.Акыркы учурда, электростатикалык өз ара аракеттенүүлөрдүн күчөшү жана натыйжада белок тармагынын катуулугу амилоиддик нуклеация үчүн зарыл болгон жаңы белок өз ара аракеттенүүсүн орнотуу үчүн белоктордун керектүү конформациялык кайра түзүлүшүнө жол бербейт.Бирок, буга ийкемдүү, суюктук сымал коацерваттарда жетишүүгө болот, алар өз кезегинде көлөмү чоңойгон сайын суюк бойдон калуу ыктымалдыгы жогору.
Чоң αS/Tau конденсаттарында конденсацияланган фазадагы агрегаттардын пайда болушу тез гелеген майда тамчыларга караганда артыкчылыктуу экендиги тамчылардын биригүүсүн башкарган факторлорду аныктоонун актуалдуулугун көрсөтөт.Ошентип, фазалык бөлүнүү тенденциясы гана эмес, конденсаттын өлчөмү туура иштеши үчүн, ошондой эле оорулардын алдын алуу үчүн көзөмөлгө алынышы керек58,61.Биздин натыйжалар ошондой эле αS/Tau системасы үчүн LLPS менен LSPT ортосундагы тең салмактуулуктун маанилүүлүгүн баса белгилейт.Тамчы түзүлүшү башка системаларда сунушталгандай каныккан шарттарда жеткиликтүү протеин мономерлеринин санын азайтуу аркылуу амилоиддик агрегациядан коргой алат, ал эми тамчылардын жогорку деңгээлдеги синтези жай конформациялык кайра түзүлүштөр аркылуу ички белоктун агрегациясына алып келиши мүмкүн.белок тармактары..
Жалпысынан алганда, биздин маалыматтар LSPT контекстинде тамчы тармактардагы когезициялык валенттүүлүктүн жана канааттандырылган/канааттандырылбаган өз ара аракеттенүүнүн актуалдуулугун катуу баса белгилейт.Атап айтканда, биз толук узундуктагы αS/Tau441 конденсаттары эки белокторду камтыган амилоид сымал гетероагрегаттарды түзүү үчүн эффективдүү биригип, ядро ​​түзө аларын көрсөтөбүз жана эксперименталдык натыйжалардын негизинде молекулярдык механизмди сунуштайбыз.Биз бул жерде билдирген αS/Tau суюктук коасерватындагы эки протеиндин биргелешип кошулушу чындыгында оорунун белгилери болуп саналган кошулмалардагы эки протеиндин биргелешип локализацияланышына байланыштуу болушу мүмкүн жана LLPS менен амилоиддик агрегация, нейродегенерацияда жогорку заряддуу IDP үчүн жол ачат.
Мономердик WT-αS, цистеин мутанттары (Q24C-αS, N122C-αS) жана ΔCt-αS варианттары (Δ101-140) E. coliде экспрессияланган жана мурда сүрөттөлгөндөй тазаланган.5 мМ DTT дисульфиддик байланыштын пайда болушуна жол бербөө үчүн αS цистеин мутанттарын тазалоонун бардык баскычтарына киргизилген.Tau441 изоформасы (Addgene №16316дан алынган плазмида), ΔNt-Tau варианты (Δ1–150, IVAны CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC (G23purified-Viantified G2316) жана Agg1-5 менен клондоо аркылуу алынган. 5 праймер) E. coli культуралары болгон OD600 = 0.6-0.7 37 ° C жана 180 rpm чейин өскөн жана сөз 37 ° C 3 саат бою IPTG менен индукцияланган.4 °C боюнча 15 мүнөт 11,500 xg боюнча Harvest клеткалары жана 150 мM NaCl камтыган туз буфери менен жууп.1 L LB үчүн 20 мл: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 мМ, MgCl2 0.2 мМ, DTT 5 mM, PMSF 1 мМ, benzamidine μM10 μM 50p) лизис буферинде гранул кайра суспензия.Ультрадыбыс менен кадам 10 импульс үчүн 80% амплитудасы менен музда аткарылган (1 мин күйгүзүү, 1 мүнөт өчүрүү).Бир УЗИде 60 млден ашпаңыз.E. coli лизаттары 95°С температурада 20 мүнөт ысытылган, андан кийин музда муздатылган жана 127000×г центрифугада 40 мүнөттөй болгон.Тазаланган үстүнкү зат 3,5 кДа мембранага (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Улуу Британия) колдонулуп, 4 л диализ буферине (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2, DTTm 2m) каршы диализдешти. , PMSF 0,1 мМ) 10 саатка.5 мл катион алмашуу колонкасы (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, АКШ) тең салмактуулук буфери (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, PMSF, 01) менен теңдештирилди.Тау лизат 0,22 мкм PVDF чыпкасы аркылуу чыпкаланган жана 1 мл/мин агымдын ылдамдыгы менен колоннага сайылган.Элюция акырындык менен жүргүзүлдү, tau 15-30% элюция буфери (20 мМ MES, pH 6,8, 1 М NaCl, 1 мМ EDTA, 2 мМ MgCl2, 2 мм DTT, 0,1 мМ PMSF) менен элюцияланды.Фракциялар SDS-PAGE тарабынан анализденди жана күтүлгөн молекулярдык салмагы менен бир тилкесин камтыган бардык фракциялар 10 кДа центрифуга фильтринин жардамы менен концентрацияланды жана 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM жана DTT 2 mM камтыган буфер менен алмаштырылды. акыркы белок концентрациясы 100 мкм болгон.Андан кийин белок эритмеси 0,22 мкм PVDF фильтринен өтүп, тез тоңдурулуп, -80°Cде сакталган.Protein K18 боорукердик менен Prof. Alberto Boffi тарабынан берилген.Даярдыктын тазалыгы SDS-PAGE жана MALDI-TOF/TOF тарабынан тастыкталган >95% болгон.Ар кандай цистеиндер химиялык түрдө AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, АКШ) же TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада) менен белгиленген.абсорбенция жана MALDI-TOF/TOF менен тастыкталган.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau жана K18 ошол эле процедурадан кийин Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Германия) колдонуу менен 191 жана 322 позицияларында жергиликтүү цистеиндин калдыктары менен белгиленген.αS жана Tau441 үчүн калдыктар үчүн таза төлөм CIDER66 аркылуу түзүлдү.
Катуу поли-L-лизин (pLK DP 90-110 NMR боюнча жеткирүүчү, Alamanda Polymers Inc, Хантсвилл, Алабама, АКШ) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 тен 10 mM концентрациясында эриди, процесс 5 ультрадыбыс менен иштетилди. мүнөт УЗИ суу мончодо жана сактоо -20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) жана FITC-dextran-500 (Sigma -Oldrich, Sant Louis, MI, USA) сууда эрүүчү жана LLPS буферинде кеңири таралган.Диализ булганган туздарды жок кылат.Андан кийин алар 0,22 мкм тешик өлчөмү менен шприц фильтринен чыпкаланган жана алардын концентрациясы рефрактометрдин жардамы менен эсептелген (Меттлер Толедо, Колумбус, Огайо, АКШ).LLPS үлгүлөрү төмөнкү тартипте бөлмө температурасында даярдалган: буфер жана экструзия аралаштырылды жана 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etan- 1, 2-дийлдинитрил) тетраассус кислотасы (ЭДТА, карбоксинт) жана 1% протеаза ингибиторунун (PMSF 100 мМ, бензимид 1 мМ, лейпептин 5 мкМ) аралашмасы.Андан кийин αS жана бириктирилген поликатиондор (пЛК же Tau варианттары) кошулат.Тиофлавин-Т убакыт сериялары эксперименттери үчүн (ThT, Carbosynth, Compton, UK) жалпы ThT концентрациясын αS концентрациясынын жарымы үчүн колдонуңуз.Үлгүлөрдү бир тектүү болушу үчүн акырын, бирок кылдат аралаштырыңыз.Натыйжалар бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй, ар бир компоненттин концентрациясы эксперименттен экспериментке өзгөрүп турду.Эксперименттин узактыгы 4 сааттан ашкан сайын азид 0,02% (w/v) концентрациясында колдонулган.LLPS үлгүлөрүн колдонуу менен бардык анализдер үчүн, анализге чейин аралашманы 5 мүнөт тең салмактуулукка келтирүүгө мүмкүнчүлүк бериңиз.Жарыктын чачыранды анализи үчүн 150 мкл үлгүлөр байланышпаган 96 көзөнөктүү микропластинкаларга жүктөлгөн (µClear®, кара, F-Төмөн/Мур кудугу, Greiner bio-one, Kremsmünster, Австрия) жана жабышчаак пленка менен капталган.LLPs CLARIOstar пластина окугучунда (BMG Labtech, Ортенберг, Германия) эритменин борборунда 350 нм абсорбенцияны өлчөө аркылуу көзөмөлдөндү.Эксперимент 25°Сте үч нускада жүргүзүлүп, каталар орточо көрсөткүчтөн стандарттык четтөө катары эсептелген.Суюлтулган фаза үлгүнү центрифугалоо жана SDS-PAGE гел анализи аркылуу сандык бааланган, ал эми суюлтулган жана концентрацияланган фазалардагы αS фракциясы ар кандай LLPS эритмелеринде сандык бааланган.1 μM AF488-белгиленген αS камтыган 100 мкл LLPS үлгүсү кылдат аралаштырып, андан соң 9600×g центрифугалоодон кийин 30 мүнөткө даярдалды, андан кийин чөкмө адатта көрүнүп турган.Жогорку 50 мкл супернатант SDS-PAGE гелинин жардамы менен протеинди аныктоо үчүн колдонулган.Гельдер AF488 фильтрлери менен ChemiDoc гелди сүрөттөө тутумун (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, АКШ) колдонуп сканерден өткөрүштү же Coomassie боёгу менен боёлуп, тиешелүү чыпкалар менен визуализацияланды.Натыйжадагы тилкелер ImageJ версиясы 1.53i (Улуттук Саламаттыкты сактоо Институту, АКШ) аркылуу талданды.Тажрыйбалар окшош натыйжаларга ээ болгон эки башка экспериментте эки нускада жүргүзүлдү.
Адатта, 150 мкл үлгүлөр байланышпаган 96 уячалуу микропластинкаларга колдонулуп, бөлмө температурасында Leica DMI6000B инверттелген микроскопто (Leica Microsystems, Wetzlar, Германия) көрсөтүлдү.Тажрыйбалар үчүн µ-Slide Angiogenesis плиталары (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) же 96 уячалуу полистирол микропластиналар (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) да колдонулган.Жарыктандыруу булактары катары EL6000 галоген же сымап металл галогендик лампалары колдонулган (тиешелүүлүгүнө жараша BF/DIC жана WF сүрөттөө үчүн).WF микроскопиясы үчүн үлгүдөгү жарыкты фокустоо жана аны чогултуу үчүн 40 эсе чоңойтуучу аба объектиси (Leica Microsystems, Германия) колдонулган.AF488 жана ThT менен белгиленген үлгүлөр үчүн стандарттык GFP чыпкалары менен чыпкалоону жана чыгарууну, 460–500 нм жана 512–542 нм өткөргүч чыпкаларын жана 495 нм дихроикалык күзгү менен дүүлүктүрүү жана эмиссия өткөрүүчү чыпкаларды.Atto647N менен белгиленген үлгүлөр үчүн 628–40 нм жана 692–40 нм дүүлүктүрүүчү жана эмиссия диапазонунун чыпкалары менен Cy5 чыпкаларынын стандарттуу топтому жана 660 нм дихроикалык күзгү колдонулган.BF жана DIC микроскопиясы үчүн, ошол эле чагылдырылган жарык чогултуу объектисин колдонуңуз.Чогулган жарык Leica DFC7000 CCD камерасында (Leica Microsystems, Германия) жазылган.Экспозиция убактысы BF жана DIC микроскопиялык сүрөттөө үчүн 50 мс жана WF микроскопиялык сүрөттөө үчүн 20-100 мс болгон.Салыштыруу үчүн, ThT менен бардык эксперименттер үчүн экспозиция убактысы 100 мс болгон.Тамчылардын биригүүсүн визуализациялоо үчүн убакыттын өтүшүп кеткен эксперименттер аткарылды, сүрөттөр ар бир 100 мс бир нече мүнөткө чогултулуп турду.ImageJ (NIH, АКШ) сүрөт талдоо үчүн колдонулган.Окшош натыйжалар менен эксперименттер үч нускада жүргүзүлдү.
Коллокализация эксперименттери, FRAP жана 3D реконструкциясы үчүн сүрөттөр Zeiss LSM 880 инверттелген конфокалдык микроскопто ZEN 2 көк басылышын колдонуу менен алынган (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия).50 мкл үлгүлөр µ-Slide Angiogenesis Петри табактарына (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Германия) колдонулду, гидрофилдик полимер (ibiTreat) менен иштетилди жана 63× майга батыруу объектисине орнотулду (Plan-Apochromat 63×il/NA 1.4) DIC боюнча).Сүрөттөр 458 нм, 488 нм жана 633 нм аргон лазердик линияларын колдонуу менен 0,26 мкм/пиксел жана экспозиция убактысы 8 мкс/пиксел дүүлүктүрүү жана чыгарууну аныктоо терезелери үчүн 470–600 – 36 нм, жана 638–755 нм тиешелүүлүгүнө жараша ThT, AF488 жана Atto647Nди көрүү үчүн колдонулган.FRAP эксперименттери үчүн ар бир үлгүдөгү убакыттын өтүшү менен сүрөткө тартуу секундасына 1 кадр менен жазылган.Тажрыйбалар ушундай эле натыйжалар менен бөлмө температурасында үч нускада жүргүзүлдү.Бардык сүрөттөр Zen 2 blue edition программалык камсыздоону колдонуу менен талданды (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германия).FRAP ийри сызыктары нормалдаштырылган, графиктери түзүлгөн жана OriginPro 9.1 аркылуу Zen 2 аркылуу сүрөттөрдөн алынган интенсивдүүлүк/убакыт маалыматтарына ылайыкташтырылган.Калыбына келтирүү ийри сызыктары молекулярдык диффузияны эсепке алуу үчүн моно-экспоненциалдык моделге орнотулган, ал агартуучу эффектти эсепке алуу үчүн кошумча экспоненциалдык мөөнөткө ээ.Биз андан кийин D номиналдык агартуунун радиусун жана мурда аныкталган калыбына келтирүү жарым ажыроо мезгилин Канг ж.б. теңдемедегидей эсептеп чыктык.5 35 көрсөтүлгөн.
αS бир цистеиндик варианттары 24 (TEMPOL-24-αS) жана 122 (TEMPOL-122-αS) позицияларында 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) менен синтезделген, тиешелүү түрдө.Spin Labeling EPR эксперименттери үчүн αS концентрациясы 100 μM жана PEG концентрациясы 15% (w/v) болгон.Ар кандай бириктирүү шарттары үчүн αS: pLK катышы 1:10 болгон, ал эми αS: ΔNt-Tau жана αS: Tau441 катышы 1:1де сакталган.Толуп кетпеген шартта титрлөө эксперименттери үчүн TEMPOL-122-αS 50 мкм сакталган жана поликатиондор ар бир шартты өзүнчө даярдап, жогорулаган концентрацияда титрленген.CW-EPR өлчөөлөрү ~9,7 ГГц микротолкундуу (SHF) жыштыгында иштеген Bruker ER4118 SPT-N1 резонатору менен жабдылган Bruker ELEXSYS E580 X-диапазон спектрометрин колдонуу менен жүргүзүлдү.Температура 25°Сге орнотулуп, суюк азот криостат менен көзөмөлдөнөт.Спектрлер каныкпаган шарттарда 4 мВт кубаттуулукта, 0,1 мТ модуляция амплитудасында жана 100 кГц модуляция жыштыгында алынган.Тау441 же ΔNt-Tau (оригиналдуу белок эритмелеринде бар) камтыган үлгүлөрдөгү калыбына келтирүүчү агенттердин калдык концентрацияларынан улам үлгүлөрдүн ортосундагы спиндин концентрациясындагы айырмачылыктарды жана мүмкүн болгон спиндин кыскарышын болтурбоо үчүн спектрдик интенсивдүүлүк нормалдаштырылган.Берилген g маанилери Matlab®67де ишке ашырылган Easyspin программасын (v. 6.0.0-dev.34) колдонуу менен аткарылган EPR спектралдык моделдөөнүн натыйжасында алынган.Маалыматтарды моделдөө үчүн бир/эки компоненттүү изотроптук моделдер колдонулган.Бардык сигналдарды нормалдаштыргандан кийин калдыктар тиешелүү эксперименталдык спектрден ар бир симуляцияны алып салуу менен эсептелди.Байланыштуу титрлөө анализи үчүн поликатиондордун αS ​​менен байланышын көзөмөлдөө үчүн нормалдаштырылган EPR спектринин (IIII/III) экинчи тилкесинин үчүнчү тилкесинин салыштырмалуу интенсивдүүлүгү колдонулган.Диссоциациялануу константасын (Kd) баалоо үчүн, алынган ийри n окшош жана көз карандысыз байланыш жерлерин болжолдоочу болжолдуу моделге орнотулган.
ЯМР спектроскопиялык эксперименттери криопроб жана Z-градиент менен жабдылган Bruker Neo 800 MHz (1H) ЯМР спектрометрин колдонуу менен ишке ашырылган.Бардык эксперименттер 130–207 μM αS жана 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 жана 15°Cде аткарылган тиешелүү αS/ΔNt-Tau жана pLK эквиваленттерин колдонуу менен аткарылды.NMR менен LPS мониторинг жүргүзүү үчүн, 10% PEG алдын ала аралаштырылган үлгүлөргө кошулду.Химиялык жылыштын бузулуу графиги (1б-сүрөт) орточо 1Н жана 15Н химиялык жылыштарды көрсөтөт.αS 2D1H-15N HSQC спектрлери мурунку тапшырманын негизинде дайындалган (BMRB кириши №25227) жана HNCA, HNCO жана CBCAcoNH 3D спектрлерин жаздыруу жана талдоо аркылуу тастыкталган.13Cα жана 13Cβ химиялык жылыштары ΔNt-Tau же pLK катышуусунда эсептелген, 68 таза кокустук катушка конформациясындагы αS химиялык жылыштарына салыштырмалуу экинчи структуралык тенденциялардагы мүмкүн болгон өзгөрүүлөрдү өлчөө үчүн (Кошумча сүрөт 5c).R1ρ ылдамдыгы 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 жана 800 мс кечигүү менен hsqctretf3gpsi эксперименттерин (Брукер китепканасынан алынган) жазуу менен өлчөнгөн жана экспоненциалдык функциялар ар кандай интенсивдүүлүктө эң жогорку кечигүүлөргө туураланган. R1ρ жана анын эксперименттик белгисиздигин аныктоо үчүн жолу.
Эки түстүү убакыт боюнча чечилген флуоресценттик микроскопиялык эксперименттер убакыт менен байланышкан бир фотонду эсептөө (TCSPC) аппараты менен коммерциялык убакытта чечилген MT200 флуоресценттик конфокалдык микроскопто (PicoQuant, Берлин, Германия) аткарылды.Лазердик диоддун башы импульстук аралаш дүүлүктүрүү (PIE) үчүн колдонулат, нур бир режимдеги толкун өткөргүчтөн өтөт жана 481 нм жана 637 нм лазердик линиялар үчүн 10дон 100 нВтка чейинки лазердин кубаттуулугуна крондолгон.Бул фотонду лакаптоо, фото агартуунун жана каныккандыктын таасиринен качуу менен фотонду эсептөөнүн оптималдуу ылдамдыгын камсыздайт.μ-Слайд ангиогенезинин капталдары же плиталары (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия) түздөөчү жакасы бар Super Apochromat 60x NA 1.2 линзасынын үстүнө чөмүлүүчү сууга түз салынды (Olympus Life Sciences, Waltham, АКШ).Негизги нур бөлгүч катары 488/640 нм дихроикалык күзгү (Semrock, Lake Forest, IL, АКШ) колдонулган.Фокусталбаган нурлануу диаметри 50 микрон болгон тешик менен жабылат, андан кийин фокусталган нурлануу 50/50 нур бөлгүч менен 2 аныктоочу жолго бөлүнөт.Детектордун алдында жашыл боёк үчүн 520/35 (AF488) жана кызыл боёк үчүн (Atto647N) тилкелүү эмиссия фильтрлери (Semrock, Lake Forest, IL, USA) колдонулган.Детекторлор катары бир фотондуу көчкү диоддору (SPAD) (Micro Photon Devices, Болзано, Италия) колдонулган.Маалыматтарды чогултуу да, талдоо да коммерциялык жеткиликтүү SymphoTime64 программасын (PicoQuant GmbH, Берлин, Германия) колдонуу менен аткарылган.
Элүү микролитр LLPS үлгүлөрү μ-Слайд ангиогенез скважиналарына колдонулган (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германия).Натыйжада алынган сүрөттөр скважинанын түбүнөн 20 мкм бийиктикке, асма тамчылар үчүн оптималдуу объективдүү иштөө аралыкка жана октук резолюциясы 0,25 мкм/пикселден кем эмес жана 400 мкм/пиксел кечигүү убактысы менен салдар жана чекиттер үчүн ~1 мкм чейин багытталган.Ар бир канал үчүн орточо фон сигналынын интенсивдүүлүгүнүн (PBG, орточо + 2σ) негизинде интенсивдүүлүк босогосун колдонуу менен маалыматтарды тандаңыз, ошентип дисперстүү фазадан кандайдыр бир мүмкүн болгон келип чыгууну чыпкалоо менен суюк протеин тамчылары, салдар же тактар ​​тандалат.Ар бир каналдын ар бир түрүнүн (τ) өмүрүнүн узактыгын талдоо үчүн (жашыл, AF488 үчүн “g” жана кызыл, Atto647N үчүн “r”) биз тамчыларды, салдарды же тактарды камтыган кызыккан аймактарды (ROI) тандап алдык (Кошумча 1-сүрөт 1). ).8b) жана аларды ар бир каналга алардын өмүр бою ажыроосун (тамчылар, салдар же тактар ​​үчүн τD, τR жана τP, тиешелүүлүгүнө жараша, Кошумча 8c-сүрөттү караңыз) ар бир каналга куйруктуу талдоо жана эки компоненттүү ажыроо моделин колдонуу менен алынган.Орточо τ баштап τ.Көп экспоненциалдуу туура келүү үчүн өтө аз фотондорду чыгарган ROIлер анализден чыгарылды.Колдонулган кесүү салдар жана чекиттер үчүн <104 фотон жана тамчылар үчүн 103 фотон болгон.Тамчылардын босогосу төмөн, анткени интенсивдүүлүгү жогору болгон ажыроо ийри сызыктарын алуу кыйын, анткени сүрөт талаасындагы тамчылар адатта кичине жана азыраак.Фотондун топтолуу чегинен (> 500 саны/пикселге белгиленген) фотондордун саны ROI да талдоо үчүн жок кылынды.Кызыккан аймактан алынган интенсивдүүлүктүн бузулуу ийри сызыгын максималдуу интенсивдүүлүктүн 90% (чийүүнүн максималдуу интенсивдүүлүгүнөн бир аз кийин) кызмат мөөнөтүнүн башталышынан тартып, бардык интенсивдүү ажыроо үчүн бирдей сактоо менен минималдуу IRF кийлигишүүсүн камсыз кылуу үчүн дал келтириңиз. орнотуулар Салыштырмалуу убакыт терезеси Салдар жана тактар ​​үчүн 25-50 ROI жана тамчылар үчүн 15-25 ROI талданды, сүрөттөр жок дегенде 3 көз карандысыз эксперименттен жазылган 4 репликациядан тандалып алынган.Эки куйруктуу t-тесттер түрлөрдүн ортосундагы же коасерват системаларынын ортосундагы статистикалык айырмачылыктарды баалоо үчүн колдонулган.Өмүр мөөнөтүн (τ) пикселдик-пикселдик анализдөө үчүн ар бир канал үчүн талаадагы жашоо убакытынын жалпы алсырашы эсептелген жана 2/3-компоненттүү экспоненциалдык алсыздануу моделинин жакындоосу жүргүзүлгөн.Ар бир пиксел үчүн өмүр бою алсыздануу мурда эсептелген τ маанилери менен орнотулуп, натыйжада псевдоколор FLIM ылайыктуу сүрөт пайда болду.Куйрукка ылайыктуу жашоо диапазону бир эле каналдын бардык сүрөттөрүндө бирдей болгон жана ар бир ажыроо ишенимдүү дал келүүнү камсыз кылуу үчүн жетиштүү фотондорду чыгарган.FRET анализи үчүн пикселдер 11 фотондун фондо сигналын (FBG) орточо болгон 100 фотондун төмөнкү интенсивдүүлүк босогосун колдонуу менен тандалган.Ар бир каналдын флуоресценция интенсивдүүлүгү эксперименталдык түрдө аныкталган коррекциялык факторлор менен коррекцияланган: 69 спектралдык кайчылаш α 0,004, түз дүүлүктүрүү β 0,0305, аныктоонун эффективдүүлүгү γ 0,517.Пиксел деңгээлиндеги FRET эффективдүүлүгү төмөнкү теңдемени колдонуу менен эсептелет:
мында FDD - донордук (жашыл) каналда байкалган флуоресценция интенсивдүүлүгү, FDA - кыйыр дүүлүккөндө акцептордук (кызыл) каналда байкалган флуоресценция интенсивдүүлүгү, ал эми FAA - түз дүүлүккөндө акцептордук (кызыл) каналда байкалган флуоресценция интенсивдүүлүгү ( PIE).Каналда флуоресценция интенсивдүүлүгүнүн импульстары байкалат).
LLPS буферине (жогоруда айтылгандай толукталган) 25 мкМ этикеткаланбаган мономердик Tau441 (25 мкМ αS бар же жок) камтыган 100 мкл LLPS реакция эритмелерин чаптама фольга менен капталган 96 көзөнөктүү микропластинкаларга салыңыз жана тамчылардын пайда болушу WF микроскопиясы менен текшерилгенден кийин тең салмактуулук.10 мүнөттүн ичинде.Бөлмө температурасында 48 саат инкубациялоодон кийин белок салдардын жана тактардын бар экендиги тастыкталды.Андан кийин кылдаттык менен кудуктардан салдардын үстүндөгү суюктукту алып салыңыз, андан кийин 50 L диссоциациялоо буферин (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 мМ DTT) кошуп, 10 мүнөт инкубациялаңыз.Туздун жогорку концентрациясы LLPSтин PEG калдыгынан улам кайталанбашын камсыздайт жана электростатикалык өз ара аракеттешүү аркылуу гана пайда болгон мүмкүн болгон протеиндик жыйындар демонтаждалат.Андан кийин скважинанын түбү микропипетка учу менен кылдаттык менен кырылып алынып, алынган эритме бош байкоо скважинасына которулган.Үлгүлөрдү 50 мкм ThT менен 1 саатка инкубациялагандан кийин, обочолонгон тактардын бар экендиги WF микроскопиясы менен текшерилди.PBS 70-мкМ αS эритмени 300 мкл pH 7,4, натрий азиди 0,01% 37 °C жана 200 rpm менен орбиталык чайкагычта 7 күн инкубациялоо менен sonicated αS фибрилдерин даярдаңыз.Андан кийин эритме 9600 × г 30 мүнөт центрифугаланган, гранул PBS pH 7.4 ичинде кайра токтотулган жана sonicated (1 мүн, 50% цикл, Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, АКШ) фибрил үлгүлөрү 80% амплитудасы. кичинекей фибрилдердин салыштырмалуу бирдей өлчөмдө бөлүштүрүлүшү менен.
FCS/FCCS анализи жана эки түстүү кокустуктарды аныктоо (TCCD) PIE режимин колдонуу менен FLIM-FRET микроскопиялык эксперименттер үчүн колдонулган ошол эле MT200 убакытта чечилген флуоресценттик конфокалдык микроскопто (Пико-Квант, Берлин, Германия) аткарылды.Бул эксперименттер үчүн лазердин күчү 6,0 мкВт (481 нм) жана 6,2 мкВт (637 нм) кошулду.Бул лазердик күчтөрдүн айкалышы оптималдуу эсептөө ылдамдыгына жетүү жана фотобелгилүү жана каныккандыкка жол бербөө үчүн колдонулган флюорофорлордун жуптары үчүн окшош жарыкты өндүрүү үчүн тандалган.Маалыматтарды чогултуу да, талдоо да коммерциялык жеткиликтүү SymphoTime64 версиясы 2.3 программалык камсыздоону колдонуу менен аткарылган (PicoQuant, Берлин, Германия).
LLPS колдонуу менен алынган обочолонгон αS/Tau агрегаттарынын үлгүлөрү изоляция буферинде тиешелүү мономолекулярдык концентрацияга чейин суюлтулган (адатта 1:500 суюлтуу, анткени агрегаттар коацерват үлгүлөрүнөн бөлүнүп алынганда төмөн концентрацияда болот).Үлгүлөр 1 мг/мл концентрациясында BSA эритмеси менен алдын ала капталган жабындарга түздөн-түз колдонулган (Корнинг, АКШ).
Жашыл жана кызыл каналдардагы PIE-smFRET анализи үчүн мономердик окуялардан улам аз интенсивдүүлүктөгү сигналдарды чыпкалоо үчүн 25 фотондун төмөнкү интенсивдүүлүк босогосу колдонулган (мономерлер обочолонгон агрегаттарга салыштырмалуу топтолгон үлгүлөрдөн көп экенин эске алыңыз).Бул чек талдоо үчүн агрегаттарды атайын тандоо үчүн таза мономер үлгүлөрүн талдоодон алынган мономердик αS орточо интенсивдүүлүгүнөн беш эсе эсептелген.PIE дискинин схемасы, TSCPC маалыматтарын алуу менен бирге, фон жана спектралдык кайчылашууну жок кылууга жардам берген өмүр бою салмак чыпкасын колдонууга мүмкүнчүлүк берди.Жогорудагы босоголорду колдонуу менен тандалган жалындын интенсивдүүлүгү буфердик үлгүлөрдүн интенсивдүүлүгүнө/биндин пайда болуу гистограммаларынан аныкталган орточо фон сигналын колдонуу менен оңдолду.Чоң агрегаттар менен байланышкан жарылуулар, адатта, убакыт трассасында (1 мс коюлган) катары менен бир нече кутуларды ээлейт.Бул учурларда, максималдуу күч бин тандалган.FRET жана стехиометриялык анализ үчүн теориялык жактан аныкталган γ (0,517) гамма фактору колдонулган.Спектрдик кайчылаш жана түз дүүлүктүрүү салымдары колдонулган дүүлүктүрүүчү лазердин кубаттуулугунда анчалык деле маанилүү эмес (экспериментте аныкталган).Жарылуудагы FRETтин эффективдүүлүгү жана стехиометриясы төмөнкүчө эсептелет.