347 Дат баспас болоттон жасалган темир тубагындагы химиялык курамдык, химиялык компонент, ар кандай тыгыз байланышкан (CLMS)

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Ар бир слайдда үч макала көрсөтүлгөн слайдерлер.Слайддар аркылуу өтүү үчүн артка жана кийинки баскычтарды же ар бир слайд аркылуу жылуу үчүн аягындагы слайд контроллер баскычтарын колдонуңуз.

Продукт Description

Дат баспас болоттон жасалган 347L Coil түтүктөрү, болот классы: SS347L

Интерферон сигналдык системасы айлана-чөйрөдөн келген патогендик жана ички патологиялык сигналдардын кеңири диапазонуна күчтүү цитокиндик жоопту жаратат, натыйжада интерферонду индукциялоочу белоктордун бөлүмчөлөрүнүн индукциясы пайда болот.Биз интерферон-индукцияланган протеиндердин доменинде жаңы протеин-белоктун өз ара аракеттенүүсүн аныктоо үчүн DSS аркылуу кайчылаш байланыш масс-спектрометриясын (CLMS) колдондук.Күтүлгөн интерферон-индукциялануучу протеиндерден тышкары, биз ошондой эле MX1, USP18, OAS3 жана STAT1 сыяктуу канондук интерферон-индукциялануучу протеиндердин жаңы молекулалар аралык жана интрамолекулярдык кайчылаш кошулмаларын аныктадык.Биз HLA-A протеиндери (H2BFS-HLA-A-HMGA1) тарабынан түзүлгөн интерферон-индукциялануучу протеиндик тармактардын жаңы топтомун ортогоналдык валидациялоого жана ко-иммунопреципитацияны колдонууга жана аларды молекулярдык динамикалык моделдөө аркылуу андан ары изилдөөгө көңүл бурдук.Белок комплексинин конформациялык динамикасын моделдөө CLMS жыйынтыктарында аныкталган өз ара аракеттенүүнү чагылдырган бир нече өз ара аракеттенүү сайттарын ачып берди.Биргеликте, биз интерферон менен шартталган жаңы сигналдык комплекстерди аныктоо үчүн CLMS боюнча пилоттук изилдөөнү сунуштайбыз жана шишик микрочөйрөсүндөгү протеиндердин өз ара аракеттенүүсүнүн жаңы динамикасын аныктоо үчүн CLMSтин кеңири колдонулушун чыдамсыздык менен күтөбүз.
Адаптивдүү иммундук жооп башталганга чейин, кожоюндун тубаса коргонуу системасы интерферондор (IFNs) деп аталган секрецияланган альфа-спиралдуу цитокиндердин үй-бүлөсү аркылуу микробго каршы жооп берет.I типтеги IFN класстары IFNα жана IFNβ клеткалык жоопторду, анын ичинде вируска каршы, проапоптотикалык, сезгенүүгө каршы жана антипролиферативдик абалдарды активдештирет.Адамдарда IFNαнын 13 түрү белгилүү, баары 91-хромосомада топтолгон. Таң калыштуусу, клиникалык колдонуу үчүн IFNα2 гана изилденген.Акыркы убакта өзгөчө көңүл IFNα башка субтиптери боюнча изилдөөгө бурулган.Жакында жүргүзүлгөн изилдөө IFNα14 канондук IFNα2 түрүнө салыштырмалуу HBV2 жана HIV-13,4 репликациясын чектөөдө эң эффективдүү изоформалардын бири экенин көрсөттү.
Активдештирилген типтеги I типтеги интерферон рецептордук комплекстери (IFNAR1 жана IFNAR2) Янус киназалары TYK2 жана JAK15,6 ортомчулугу менен сигнал берүү каскадын ишке ашырары аныкталган.Бул Янус киназалары SH2 доменинин гетеродимеризациясын6 баштоо үчүн тирозин калдыктарында сигнал өзгөрткүчтөрүн жана транскрипциялык белок активаторлорун (STAT1 жана STAT2) фосфорлайт.Кийинчерээк, IRF9 IFN-стимулдашкан фактор 3 генинин (ISGF3) тримердик комплексин түзүү үчүн STAT гетеродимерлерин байланыштырат, ал ядрого көчүп, 2000ден ашык интерферон стимулдаштырылган гендердин (ISGs) транскрипциясын индукциялайт5,6,7,8.
ISGs тубаса иммундук системанын негизин түзөт, айрыкча вирустук чабуулга жооп катары.Вирустук инфекциядан коргонуунун биринчи линиясы катары клеткалар биологиялык активдүүлүктүн кеңири спектри менен клеткалык протеиндердин кеңири өз ара аракеттенүүсүн тез жайылтат.Бул белоктор кирет, молекулалар, транскрция факторлорун, протоколдук факторлорду, белокторго түздөн-түз айырмачылыкты, ошондой эле иммундук жооптордун терс жөнгө салуучу протеиндер кирет.ISG активдүүлүгү жөнүндө маалыматтын көбү ашыкча экспрессияланган экрандарды 10,11 же генди өчүрүү ыкмаларын (siRNA, RNAi жана CRISPR)12,13 колдонгон функционалдык экрандардан келет, мында жеке ISGs экспрессияланган же бөгөттөлгөн жана алардын активдүүлүгү ар кандай вирустарда текшерилет.Бул изилдөөлөр жеке ISGs антивирустук касиеттерин аныктаган болсо да, ар бир ISG негизги молекулярдык механизмдери негизинен белгисиз бойдон калууда.Көптөгөн протеиндер толук активдүүлүктү камсыз кылуу үчүн бир же бир нече цитокиндер менен өз ара аракеттенишет, ошондуктан же ISGs түздөн-түз өз ара аракеттенет же алардын өз ара аракеттенүүсү клеткалык протеиндер аркылуу ишке ашат.Мисалы, акыркы photocrosslinked протеомика изилдөө ATPase VCP / p97 негизги IFITM3 өз ара өнөктөш катары аныкталган, анын бөгөт коюу lysosomal сорттоо, жүгүртүү жана вирустук бөлүкчөлөр 14 менен IFITM3 менен cotransport кемчиликтерге алып келет.Иммунопреципитацияны колдонуп, биз VAPA, везикула менен байланышкан протеинди IFITM1/2/3 менен өз ара аракеттенүү өнөктөшү катары аныктадык, ал холестерол аркылуу вирустун жетилишине ортомчулук кылат жана бул ачыткы эки гибриддик системаны колдонуу менен дагы бир изилдөө менен тастыкталды.Илимий колдоо 15, 16.
Инфекцияны жана залалдуу трансформацияны басууга катышкан фундаменталдуу биологиялык процесс антигендин презентациясы болуп саналат, ал негизги гисто шайкештик комплекси (MHC) молекулалары аркылуу ишке ашат.Пептиддер (8-12 аминокислоталар узундугу) ажыраган, мөөнөтүнөн мурда токтотулган же туура эмес бүктөлгөн белоктор MHC-I гетеродимерине жүктөлөт (β-2-микроглобулин деп аталган MHC-I оор жана жеңил чынжырлардан турат; β2M) 17,18.Натыйжада туруктуу MHC-I тримерлери клетканын бетине ташылат, алар CD8+ Т-клеткаларына (цитотоксикалык Т-клеткалар)17 клетка ичиндеги пептиддерди беришет.Т-клеткалар бул козгогучтарды жана шишикке спецификалык антигенди алып жүрүүчү клеткаларды тааныйт жана жок кылат.Демек, патогендик микроорганизмдер жана шишик клеткалары иммундук көзөмөлдү болтурбоо үчүн антигенди көрсөтүү процессин басышат.Мындан тышкары, MHC-I адамдын шишиктеринин 40-90% төмөндөйт жана көбүнчө начар прогноз менен байланышкан19.
Патогендерге жооп берүүгө катышкан гендер эс алуу абалы менен активдүү транскрипция абалына тез өтүшү керек.Ошондуктан, бир нече уюлдук протеиндер промоутер хроматин 20,21 кайра жана өзгөртүү, анын ичинде кыска убакыттын ичинде жогорку IFN суроо-талаптын жооп катышат деп болжолдонууда.Көпчүлүк изилдөөлөр IFN катышуусунда жеке ISG протеин өнөктөштөрүн аныктоого багытталган.Моделдик клетка системаларында бир нече протеомикалык жана транскриптомиялык изилдөөлөр IFNдин уюлдук ландшафтка тийгизген таасирин түшүндүрдү.Бирок, интерферондордун динамикасын түшүнүү өсүп жатканына карабастан, биз дагы эле ISGs катышуусу жөнүндө аз билебиз.Интерферон сигнализациясынын татаалдыгын жана убакытка көз каранды динамикасын кароодо эки суроо туулат: (i) тез сигнализацияга катышкан көп протеиндик комплекстерди турукташтыруу жана кармоо мүмкүнбү, жана (ii) бул өз ара аракеттенүүлөрдү 3D мейкиндигинде чагылдырууга болобу?
Бул маселелерди чечүү үчүн, биз IFNα-индукцияланган протеин өз ара аракеттенүү тармагын жана анын динамикасын изилдөө үчүн масс-спектрометрия (CLMS) менен коштолгон дисукцинимиддик суберациялык химиялык кайчылаш байланышты (DSS) ишке ашырдык.DSS in vivo белоктордун жана/же белок комплекстеринин проксималдык калдыктарынын ортосундагы коваленттик байланыштарды кошот.Кийинки MS анализи белгилүү бир протеиндин ичиндеги аймактардын мейкиндикте жакындыгын чагылдырган белгилүү кайчылаш сайттарды ачып берет, алар ички байланыштар деп аталат, же протеин комплекстериндеги өз ара байланыштар деп аталат.Бул ыкманы колдонуу менен биз бир нече жаңы протеин-белок комплекстерин, ошондой эле интерферон менен шартталган көп протеиндик өз ара аракеттенүү тармактарын аныктадык.Бул жаңы өз ара аракеттенүүлөрдүн бир бөлүгүн андан ары сынап көрүү менен, биз H2BFS (H2B гистон түрүндөгү FS; мындан ары H2B деп аталат) жана MDN1 HLA-A үчүн милдеттүү өнөктөш катары иштээрин көрсөтөбүз.
Flo-1 клеткалары кызыл өңгөчтүн аденокарциномасынын эң белгилүү in vitro моделдеринин бири болуп саналат, анткени алар кызыл өңгөчтүн шишиктеринин негизги өзгөчөлүктөрүн туурайт22,23.Бирок, бардык шишиктер иммуногендик эмес жана Flo-1 клеткалары интерферон менен дарылоого жооп береби же жокпу, аныктоо үчүн биз Flo-1 клеткаларын 72 саат бою 10 нг/мл IFNα менен мамиле кылдык.Flo-1 клеткалары IRF1 стационардык деңгээлдеринин убакытка көз каранды азайышы менен дарылоодон 2 сааттан кийин башталып, 72 саат бою уланып, pSTAT1 жана IRF1дин эрте индукциясын көрсөттү (Figure 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 жана ISG15) IFNα үчүн классикалык орто жана кеч фаза жоопторун туурап, 6 сааттан кийин күчтүү индукцияланганы аныкталган (Figure 1A).Бул маалыматтар менен бирге бул уюлдук модель интерферон жоопторун изилдөө үчүн колдонулушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
IFNα дарылоодон кийин Flo-1 клеткаларындагы дифференциалдык протеин экспрессиялары.(A) 2, 6, 24, 48 жана 72 саат бою 10 нг/мл IFNα менен дарыланган Flo-1 клеткаларындагы белоктун экспрессиясы, көрсөтүлгөн ISG антителолорунун жардамы менен иммуноблот тарабынан талданды.(B) Coomassie көк боёлгон SDS-PAGE гелдери көрсөтүлгөн убакыттар жана концентрациялар үчүн DSS менен кайчылаш байланыштыргандан кийин бүт клетка экстрактылары.(C) Өкүл иммуноблот протеиндин кайчылаш даражасын баалоо үчүн ошол эле үлгүлөрдөн p53 (DO-1) антитело менен текшерилген.
In situ протеиндердин өз ара аракеттенүү пейзажын тартуу үчүн биз мембрананын жогорку өткөрүмдүүлүгүнө жана салыштырмалуу кыска реакция убактысына байланыштуу кеңири колдонулган кайчылаш байланыш агенти болгон DSS колдондук.Кыскараак реакция убактысы кайчылаш байланышкан протеиндердин чоң агрегаттарынын пайда болушунун алдын алууга жардам берет, ошону менен кайчылаш байланыштын туруктуулугун сактайт.Оптималдуу DSS концентрациясын аныктоо жана ашыкча кайчылаш байланышты болтурбоо үчүн, биз адегенде клеткаларды 5, 2,5 жана 1 мм DSS үчүн 5, 10, 5 жана 30 мүнөткө тийгиздик жана Лизаттарды Coomassie боёгон SDS-PAGE менен талдадык. (маалыматтар берилген эмес) .Клетка лизаттары эң төмөнкү концентрацияда жана эң кыска убакыт чекитинде өтө кайчылаш байланышта болот.Ошондуктан, DSS 5 мүнөттүн ичинде 1, 0,5 жана 0,1 мм титрленген (Figure 1B).Оптималдуу кайчылаш 5 мүнөткө 0,5 мм DSS менен байкалган жана бул шарттар IFNα менен мамиле кылган клеткалар үчүн тандалган.Мындан тышкары, Figure 1C протеин кайчылаш-байланыш даражасын баалоо үчүн p53 (DO-1) антитело колдонуу менен аткарылган Western blot көрсөтөт.
Flo-1 клеткалары кайчылаш байланыштыргычты кошуудан мурун 24 саат бою 10 нг/мл IFNα менен дарыланган.Кайчылаш байланышкан клеткалар кийин эки баскычтуу протеолиз менен lysed жана белоктор FASP (сүрөт. 2) 24,25 тарабынан иштелип чыккан.Кайчылаш байланышкан трипттик пептиддер масс-спектрометрия менен анализденди (2-сүрөт).Андан кийин MS/MS спектрлери белок ырааттуулугуна дал келет жана MaxQuant26,27 менен сандык аныкталат.SIM-XL программасын колдонуу менен алынган спектрлер аныкталган жана жеке кошулмалар Xqueft28 жана SIM-XL29 Эсептөө Программасынын ачык программалык камсыздоо программасынын ачык программалык камсыздоо программасынын ачык программалык камсыздоо (сүрөт).SIM-XL жөнөкөй же татаал протеин аралашмаларындагы белок-белок өз ара аракеттенүүсүн, ички чынжырларды жана жеке чынжырларды аныктайт жана протеин структураларындагы өз ара аракеттешүүнү визуалдаштыруу үчүн сценарийлерди берет.Мындан тышкары, ал ар бир кайчылаш шилтемени MS/MS29 спектринин сапатына ылайык ID упай катары баалайт.Бир нече өтө ишенимдүү белок-белок өз ара аракеттенүүлөрү жана комплекстери аныкталган жана молекулярдык динамикалык (МД) моделдөөнүн жардамы менен комплекстердин коиммунопреципитация жана конформациялык өзгөрүүлөрүн колдонуу менен өз ара аракеттенүүнүн жаңы комплекси андан ары изилденген (2-сүрөт) 30, 31.
CLMS ыкмасына схемалык сереп.Flo-1 клеткалары 24 саат бою 10 нг/мл IFNα менен дарыланган, андан кийин DSS аркылуу in situ протеин кайчылаш байланышы, андан кийин клетка лизиси жана трипсинациясы.Кайчылаш байланышкан үлгүлөр Orbitrap масс-спектрометринин жардамы менен талдоого алынган жана андан ары LC-MS/MS учурунда пептиддик прекурсорлордун фрагменттелиши үчүн үлгү алынган.Алынган спектрлерден Crosslinked Peptides (SIM-XL) программасынын спектрин таануу машинасынын жардамы менен эки байланышкан пептиддер аныкталды жана бардык кошулмалар эсептөө түтүктөрү аркылуу татаал тармакка бириктирилди.Жалган оң чен (FDR) упайларынын негизинде ишенимдүүлүгү төмөн өз ара аракеттерди чыпкалаңыз.Бир нече жаңы жогорку тактыктагы белок-белок өз ара аракеттенүүлөрү кошумча иммунопреципитацияны колдонуу менен тастыкталды жана комплекстердеги конформациялык өзгөрүүлөр молекулярдык динамикалык (MD) моделдөөнүн жардамы менен изилденди.
Жалпысынан ~ 30500 жана ~ 28,500 Пептидс белгиленди, тиешелүүлүгүнө жараша, стимулдаштырылган жана стимулдаштырылган IFNα үлгүлөрүндө (S1 S1, 3a-сүрөт).Пептиддердин узундугу эки учурда тең бөлүштүрүлүшү кайчылаш байланышкан пептиддердин бар экендигин көрсөтүп, чоңураак пептиддердин үлүшүн көрсөткөн (сүрөт 3B, C).Мындан тышкары, ири пептиддердин көбүрөөк үлүшү IFNα менен мамиле үлгүлөрүнүн 40-55 диапазонунда болгон (сүрөт. 3C).Log2 интенсивдүүлүгүнө каршы протеиндин картасы классикалык интерферон менен стимулдаштырылган протеиндер MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 жана HLA-F (Figure 3D) сыяктуу тазаланбаган үлгүлөргө салыштырмалуу эң көп болгонун көрсөттү.Reactome жол маалымат базасын колдонуу менен IFNα дарылоо жооп катары үч эседен ашык байытылган белоктор үчүн жолдорду талдоо MHC-I ортомчу антигенди көрсөтүү жана кайра иштетүү эң басымдуу жол экенин көрсөттү (Figure 3E).Мурунку отчетторго ылайык, OAS жана ISG15, ошондой эле IFNα / β жана цитокин сигнализациясы аркылуу ортомчулук кылган антивирустук жооптор активдештирилген жолдордун арасында болгон.Мындан тышкары, лизинге жана серинге мүнөздүү протеин кайчылаш байланыштары SIM-XL аркылуу алгач алынган MS/MS спектрлеринен аныкталган.Жакында жүргүзүлгөн изилдөө 5 клетканын түрүндөгү ISG ашыкча экспрессиясын изилдөөнүн мета-анализинин натыйжасында 9 вирус классындагы 20 вирусту камтыган 104 ISG билдирди.Бирок, чоң маалымат топтомдорун скринингдин эсептөө чектөөлөрүн жеңүү үчүн, Падария жана башкалар тарабынан билдирилген IRDS гендердин тизмесинин ортосундагы мүмкүн болгон өз ара аракеттенүүнү изилдөө үчүн биз кичине маалымат топтомунан баштадык, алардын көпчүлүгү ISGs.
Дифференциалдык түрдө билдирилген кайчылаш белокторду идентификациялоо IFNα (максималдуу алынган маалыматтар).(A) Венн Диаграммасы, эгерде ал менен тазаланган жана тазаланган эмес 1 үлгүлөрүтазаланбаган (B) жана IFNα мамиле (C) кайчылаш байланыш үлгүлөрүнүн пептиддик узундугун бөлүштүрүү.(D) Даңкталган жана IFNα14 ортосундагы байланыштардын ортосундагы журналдын (LFQ интенсивдүүлүгүн) жылуулук картасыСол панелде IFNα катышуусунда эң активдүү активдештирилген белоктор көрсөтүлөт.(E) IFNα дарылоо кийин 20 негизги байытуу жолдорун билдирген гистограмма.Reactome жол маалымат базасы жөнгө салынган IFNα-жооптуу белоктордогу төрт эседен ашык өзгөрүүлөрдү талдады.
Interferon ортомчу ISG стимулдаштыруу, ошондой эле документтештирилген, бирок молекулярдык денгээлде бул белоктор биологиялык милдеттердин кенен спектрин аяктайт кантип начар түшүнүлөт.Белгилүү ISGs ортосундагы ишенимдин жогорку даражасы менен протеиндин өз ара аракеттенүүсүн изилдедик.Кызыктуусу, биз MX1, USP18, ROBO1, OAS3 жана IFNα дарылоого жооп катары чоң комплексти түзгөн STAT1 белокторун камтыган тармакты аныктадык (Figure 4, Table S2) 32,33,34.Баарынан маанилүүсү, бул өз ара IFNα менен мамиле бардык үч жолу табылган жана алар IFNα дарылоо жооп катары атайын түзүлгөн деп божомолдоого, тазаланбаган үлгүлөрүндө табылган эмес.Стат1 транскрессалдуу түрдө ушул ISGSтин сөзүн жөнгө салат, бирок протеин деңгээлиндеги ISGS менен өз ара аракеттенүүсү изилденген эмес.STAT1дин кристаллдык структурасы анын спиралдык домени (CCD) димерлердин35 пайда болушу учурунда ДНК же протомерлер менен өз ара аракеттенүүгө катышпай турганын көрсөттү.Бул α-спиральдар өз ара аракеттенүү 35 үчүн басымдуу гидрофиликтүү беттик аянтты камсыз кылган спиралдык спиралдын структурасын түзөт.Биздин CLMS маалыматтарыбызда биз STAT1 менен өз ара аракеттенүүнүн көбү CCD, шилтеме домени же C-терминал куйругу (калдык 700-708) алдындагы SH2 доменинде болгонун байкадык (сүрөт 4A).Мурунку изилдөө USP18 STAT2 менен CCD жана ДНК-милдеттүү домени (DBD) менен байланыштырат жана түрү I интерферон сигнал 24 бөгөт коюу ортомчулук кылуу үчүн түрү I интерферон кабылдагыч IFNAR2 суббирдигине жалданган деп билдирди.Биздин маалыматтар ошондой эле USP18 каталитикалык домени STAT1 DBD (Figure 4A, D) менен өз ара аракеттенерин көрсөттү, бул STAT1 жана STAT2 экөө тең USP18ди IFNAR2ге тартууда роль ойношу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Белый протеин ISG тармагы IFNα менен дарыланган кайчылаш клеткаларда аныкталган.(A) 2D өз ара аракеттенүү сюжети белок-белок өз ара аракеттенүүсүн (SIM-XL программасында түзүлгөн), молекулалар аралык өз ара аракеттенишүүнү билдирген сызыктар менен (кайчылаш байланыштын кесилиши 3,5ке коюлган).Ар кандай окшоштуктардын домендери өзөктөрү32: MX1 домен, Dynamin_N (259-547) жана GED (569-660).OAS3 Домендер: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_Transf_2 (780-872), жана OAS1_C (903-108).Roba1, IG_3 (67-151), I-Set (170-258), I-Set (262-347), IG_3 (350-432), IG_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (678–758) жана fn3 (777–864).STAT1 талаалары: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) жана STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) кайчылаш байланышкан белоктордун тегерек көрүүчүсү (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 жана STAT1).Кайчылаш байланыш босогосу 3,5 деп белгиленген.Чекиттик графиктер MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) жана OAS3 (F) менен STAT1 өз ара аракеттенүү жерлерин, ошондой эле эки пептиддердин ортосундагы K же S өз ара аракеттенүү жерлерин көрсөтөт.Сүрөттө, кайчылаш байланыштын упай чеги 3.0 деп белгиленген.(G) STAT1 жана OAS3 DI домендеринин ортосундагы ар кандай өз ара аракеттенүү сайттары, алардын PyMolдагы протеиндик структураларына кошулган (PyMOL молекулярдык графика системасы, версия 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) жана OAS3 (pdb id: 4s3n34).) программасы.
USP18 эки isoforms адамдарда сүрөттөлгөн, басымдуу ядродо жайгашкан толук узундуктагы белок жана N-терминал домени жок изоформа, USP18-sf, ал бирдей цитоплазмада жана ядро ​​36 бөлүштүрүлөт.Мындан тышкары, N-терминусу структураланбаган жана изопептидаза активдүүлүгүн же ISG1537 байланышын талап кылбайт деп болжолдонгон.Биздин изилдөөдө аныкталган өз ара аракеттенүүлөрдүн көбү протеиндин N-терминусунда жайгашкан, бул өз ара аракеттенүүлөрдүн толук узундуктагы USP18 (Figure 4A, D) камтыганын жана ошентип, ядродо пайда болушу ыктымалдыгын билдирет.Мындан тышкары, биздин маалыматтар N-терминус протеин-белок өз ара аракеттенүү үчүн адистешкен экенин көрсөтүп турат.IFNAR2 милдеттүү сайты 312-368 калдыктарынын ортосунда жайгашкан, жана өзгөчө, комплекстеги белоктордун бири да бул аймакка байланышпайт (сүрөт 4A) 37,38.Бул маалыматтар IFNAR2 байланыштыруучу доменди кабылдагыч протеин тарабынан гана колдонуларын көрсөтүп турат.Мындан тышкары, бир гана OAS3 жана ROBO1 N-терминусу жана IFNAR2 байланышуучу сайттын жогору жагындагы домендер менен байланышкан (Figure 4A).
ROBO1 иммуноглобулин (IG) сейрек кездешүүчү молекулаларга таандык жана экстрастреллалык аймакта беш IG домендин жана үч фибронектин (FN) домендерден турат.Бул клеткадан тышкаркы домендерден кийин мембрана-проксималдык аймак жана жалгыз трансмембраналык спираль 39. Структураланбаган клетка ичиндеги аймак С-терминуста жайгашкан жана эффектордук протеинди байланыштырууга ортомчу болгон сакталган ырааттуулук мотивдерин камтыйт39.~1100дөн 1600гө чейинки аминокислоталарга чейин созулган аймак көбүнчө тартипсиз.Биз MX1 ROBO1 менен Ig, Fn жана клетка ичиндеги домендер аркылуу өз ара аракеттенишээрин, ал эми STAT1 менен өз ара аракеттенүүнүн көбү анын CCD, байланыштыргыч домени жана ROBO1дин C-терминусунун ортосунда пайда болгонун байкадык (сүрөт 4A,E).Башка жагынан алганда, DI, DIII жана OAS3 шилтеме аймактар ​​менен өз ара ROBO1 протеин боюнча бөлүштүрүлгөн (сүрөт. 4A).
Oligoadenylate synthase (OAS) белок үй-бүлөсү клетка ичиндеги кош тилкелүү РНКны (dsRNA) кабыл алып, байланыштырат, конформациялык өзгөрүүлөргө дуушар болот жана 2′,5′-байланышкан oligoadenylates (2-5 As) 40 синтезделет.Бул үч OASs арасында, OAS3 dsRNA үчүн эң жогорку жакындыгын көрсөтөт жана RNase L активдештирүү жана ошону менен вирустук 41 репликациясын чектей турган 2-5 As эң аз сумманы синтездей тургандыгы аныкталган.OAS үй-бүлөсү полимераздык бета (пол-β) сымал нуклеотид-трансфераза домендеринен турат.Мурунку изилдөөлөр C-терминалдык домендин (DIII) каталитикалык активдүүлүгү OAS342 активдештирүүсү үчүн талап кылынган dsRNA-байланыштуу доменге (DI) көз каранды экенин көрсөттү.Биз OAS3тин DI жана DII домендери CCD жана SH2 менен STAT1 TAD ортосундагы кичинекей түйүн аймагы менен өз ара аракеттенишээрин байкадык (Figure 4A, F).Протеин түзүмүндөгү ар кандай кайчылаш сайттарды каптап коюу β-баракчасы менен DBD STAT1 циклинин жана OAS3 DI доменинде 60-75 калдыктарынан түзүлгөн ачык чөнтөк же көңдөйдүн ортосундагы өз ара аракеттенүүнү аныктады (сүрөт 4G).Комплекстеги белоктордун багыты, ошондой эле OAS3 менен өз ара аракеттенүүнүн эч бири анын DI доменинин ДНК-байланыш жөндөмүнө тоскоол болбогонун көрсөттү (сүрөт S1A).Мындан тышкары, GTPase MX1 N-терминалдык домени OAS3тин DI жана DIII домендери менен кеңири өз ара аракеттенет (сүрөт 4A).Биз ошондой эле OAS1 менен MX1дин ортосундагы өз ара аракеттенүүнү IFNα менен дарыланган үч кайталоодо байкадык, мында бир OAS1 домени (ошондой эле каталитикалык активдүү) бардык үч MX1 домендери менен өз ара аракеттенген (Figure S2A, B).
MX протеиндери GTPди туташтырган жана гидролиздөөчү N-терминалдык GTPase доменин, өзүн-өзү чогултууга ортомчу орто доменди жана GTPase (LZ) ролун аткарган C-терминалдык лейцин сыдырмасын камтыган динейн сымал GTPазалардын чоң үй-бүлөсүнө кирет. ).домен эффекторунун домени25,43.MX1 вирустук гендин транскрипциясын бөгөттөө үчүн вирустук полимераздардын суббирдиктери менен байланышат43.Буга чейин билдирилген ачыткы эки гибриддик экран көрсөткөндөй, ДНК-милдеттүү ишмердүүлүктү бөгөттөө менен STO E344,45Бул жерде биз MX1дин STAT1 менен байланышаарын көрсөтөбүз (4C,D-сүрөт), бирок бул өз ара аракеттенүү IFNαга жооп катары STAT1-арачыланган гендин активдешине кандайча таасир этээрин кошумча изилдөө керек.Мындан тышкары, биз ошондой эле MX1 бардык үч IFNα менен мамиле кайталоодо IFIT3 жана DDX60 менен өз ара аракеттенген (сүрөт. S2C).
DDX60 IFN-индукцияланган цитоплазмалык геликаза болуп саналат, ал мурда вирустук RNA46нын RIG-I-көз карандысыз деградациясында роль ойной турганы кабарланган.Ал RIG-I менен өз ара аракеттенет жана анын сигнализациясын лигандга мүнөздүү түрдө активдештирет 46. DDX60 DEXD/H-Box геликаза доменинен жана вирустук РНК менен DNA47ди байланыштырган C-терминалдык геликаза доменинен турат.Анын MX1 жана IFIT3 менен өз ара аракеттенүүсүнүн көпчүлүгү канондук домендери же мотивдери жок узун N- жана C-терминал аймактарында болот (сүрөт S2E, F).Бирок, MX1 ошондой эле DEXD/H-Box helicase домени менен байланышкан (сүрөт. S2E).IFIT үй-бүлөсүнүн протеиндеринде тетрапептиддик кайталоо (TPR) деп аталган спиралга айлануу мотивинин тандемдик көчүрмөлөрү бар.IFIT3 RIG-I сигнализациясынын оң модулятору жана демек, MAVS комплексинин компоненти экени аныкталган.Чогуу алганда, биздин маалыматтар IFIT3 жана DDX60 негизинен IFIT3тин TPR 3–6 ортосундагы аймакта өз ара аракеттенет жана RIG-I/MAVS сигнализациясында роль ойной алат (сүрөт S2F).
Протеомдун бүтүндөй скрининги эсептөө интенсивдүү экенин эске алып, анда биз адамдын UniProt маалымат базасын бүтүндөй IFNα менен иштетилген кайталоолордун биринин бар-жоктугу үчүн текшердик.Бул репликада биз HLA-A үчүн бир нече өтө ишенимдүү өз ара аракеттенүү тармактарын таптык.MS / MS спектри менен аныкталган белок жолдорунун талдоо MHC-I негизинде антиген иштетүү жана презентация interferon (сүрөт. 3D) менен шартталган негизги жол экенин көрсөттү.Ошондуктан, биз бардык кайчылаш байланыш үлгүлөрүнүн ишеним жогорку даражасы менен MHC-I молекулаларынын белок өз ара изилдөөгө багытталган.HLA α1, α2 жана α3 домендерден жана жеңил чынжырларга жана микроглобулин β2 (β2M) - туруктуу chaperone protein49си турат.Бир жолу Endoplasmic Reticulumга чогултулган, Хла Пептидс Лигандс50 болбогондо туруксуз.Peptide Binding Groove жогорку полиморфиялык жана стипциялык эмес α1 жана α2 домендеринин пептид формасындагы жана салыштырмалуу азыраак полиморфиядагы α351 домени менен түзүлүп жаткан жогорку полимерфикалык жана структураланган α2 домендери тарабынан пайда болот.IFNα болгон учурда биз эки HLA-A комплексин аныктадык: бири HMGA1 жана H2B (5-сүрөт, S3-таблица) жана башкасы MDN1, LRCH4 жана H2B менен өз ара аракеттенет (6-сүрөт).
IFNα H2B (H2BFS) жана HMGA1 менен HLA-A өз ара аракеттенүү тармагын индукциялайт.(A) H2B-HLA-A-HMGA1 комплексиндеги өз ара аракеттенүүнүн ар кандай түрлөрүн чагылдырган 2D сюжет (SIM-XL программалык камсыздоосунда түзүлгөн): interlink (көк), interlink (кызыл) жана бир шилтеме (кара)..Ар түрдүү окшоштуктардагы домендер түстүү коддуу32: H2B (гистон; 2–102) жана MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 тобу; 210–290 жана MHC_I_C; 337–364).Кесилген шилтеме босогосу 3,5 деңгээлинде коюлган.Чекиттик графиктер HLA-A H2B (B) жана HMGA1 (C) менен өз ара аракеттенүү жерлерин, ошондой эле эки пептиддердин ортосундагы K же S өз ара аракеттенүү жерлерин көрсөтөт.Сүрөттө, кайчылаш байланыштын упай чеги 3.0 деп белгиленген.(D) PyMOL программасында H2B, HLA-A жана HMGA1 белокторунун структураларында көрсөтүлгөн протеиндердин ортосундагы мамилелер.Бул структуралар Phyre2 серверинин (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) жардамы менен моделдештирилген жана H2B, HLA-A жана HMGA1 белоктору үчүн шаблон структуралары тиешелүүлүгүнө жараша 1kx552, 1kj349 жана 2eze55 болгон.
IFNα H2B (H2BFS), MDN1 жана LRCH4 менен HLA-A өз ара аракеттенүү тармагын индукциялайт.(A) MDN1 тегерек түрүндө берилген 2D интерактивдүү картада (SIM-XL программасында түзүлгөн) берилген молекулярдык (кызыл) жана молекулалар аралык (көк) кайчылаш байланыштар.Кайчылаш байланыш босогосу 3,5 деп белгиленген.Ар түрдүү окшоштуктардагы домендер түстүү коддуу32: H2B (гистон; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 тобу; 210–290 жана MHC_I_C; 337–364) жана LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) жана CH (535–641)).(B) PyMOL программасында H2B, HLA-A, LRCH4 жана MDN1 белокторунун структураларында көрсөтүлгөн протеиндердин ортосундагы мамилелер.Бул структуралар H2B, HLA-A, LRCH4 жана MDN1 белоктору үчүн 1kx552, 1kj349, 6hlu62 жана 6i2665 шаблон структуралары менен Phyre2 серверин (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) колдонуу менен моделдешти. тиешелүү түрдө.H2B (C), LRCH4 (D) жана MDN1 (E) менен HLA-A үчүн K же S өз ара аракеттенүү жерлерин көрсөткөн чекиттик графиктер.участоктор үчүн, кайчылаш байланыш упай босогосу 3.0 белгиленген.
Геномдун бүтүндүгүн сактоодон тышкары, HETTONT транскрипцияны жөнгө салууга катышууда.H2B протеини илмек менен бөлүнгөн үч α-спиралдан жана C-терминал куйругу 41,52 менен түзүлгөн борбордук гистон доменинен (HFD) турат.H2B менен өз ара аракеттешүүнүн көпчүлүгү HFD HeteroDimer менен тримеризациялоону камсыз кылат (5a, b) менен тримеризациялоону камсыз кылат.Лизиндер ДНКны байланыштырууга катышса да, кээ бир лизиндер альтернативалуу ацетилдөө же метилдөөчү жерлер болуп саналат.Мисалы, H2Bден алынган K43, K46 жана K57 калдыктары ДНКнын түз байланышына катышпайт, бирок транскрипциядан кийинки ар кандай модификациялардын бутасы болуп саналат53.Ошо сыяктуу эле, H2Bдеги K44, K47 жана K57 калдыктары IFNα бар болгондо, анын ичинде башка белоктор менен өз ара аракеттенишүүдө альтернативалуу роль ойношу мүмкүн (сүрөт 5A, B).Мындан тышкары, экстрахромосомалык гистон H2B ар кандай клетка типтеринде иммундук жоопту активдештирип, инфекциялык агенттерден же бузулган клеткалардан алынган кош тизмектүү ДНКнын (dsDNA) фрагменттерин аныктоо үчүн цитозолдук сенсор катары иштейт54.ДНК вирустарынын катышуусунда H2B азайышы IFN-β өндүрүшүн жана STAT154 фосфорлануусун токтоткон.H2B ошондой эле башка негизги гистондорго караганда ядронун ичинде жана андан тезирээк жылышы белгилүү.MDN1 жана LRCH4 менен H2B өз ара аракеттенүүсү тандалган тазаланбаган үлгүлөрдө да байкалган.Биз HLA-A H2B менен IFNα менен дарыланган үч үлгүдө жана бир тазаланбаган кайталануучу үлгүдө өз ара аракеттенгенин таптык.Бул маалыматтар транскрипциялык жөнгө салуудан көз карандысыз альтернативдүү физиологиялык функцияда H2B ролун чагылдырат.
HMGA1 (жогорку мобилдүүлүк тобу AT-Hook 1), ооруну жайылтуучу аминокислоталарга бай кичинекей нуклеопротеин, HLA-A менен байланышта аныкталган.Анын кислоталуу C-терминалдык куйругу жана AT илгичтери деп аталган үч айырмаланган DBD бар, анткени алар dsDNA55,56дагы AT-бай аймактын кичинекей оюгу менен байланышат.Бул байланыш ДНКнын ийилип же түздөлүшүнө алып келет, бул канондук транскрипция факторлорунун консенсус ырааттуулугуна жетүүгө мүмкүндүк берет.С-терминалынын куйругу белок-белок өз ара аракеттенүүсүнө жана транскрипция факторлорун тартууга катышат деп эсептелинет, анткени С-терминалын өчүрүү мутанттары транскрипцияны баштоого жөндөмсүз57.Мындан тышкары, бул домен киназалар 58 үчүн белгилүү субстрат болуп саналган бир нече сакталган phosphorylation сайттарды камтыйт.Биз C-терминал доменинен тышкары HMGA1 менен HLA-A жана H2B өз ара аракеттенүүсүн байкадык, бул C-терминал домени негизинен транскрипция факторун байланыштыруу үчүн колдонулат (сүрөт 5A, C).HMGA протеиндери адаптер ДНКсы менен байланышуу үчүн H1 гистону менен атаандашып, ошону менен жеткиликтүүлүктү жогорулатат57.Ошо сыяктуу эле, HMGA гистон H1 менен атаандашып, линкер ДНКсы боюнча гистон H2B менен өз ара аракеттенет окшойт.HMGB1 дендриттик клеткаларда HLA-A, -B жана -C экспрессиясын жаратып, алардын активдештирилишине алып келет59, бирок HMG жана HLA ортосундагы өз ара аракеттенүү мурда билдирилген эмес.Биз HMGA1 HLA-A нын α1 жана α3 домендери менен өз ара аракеттенишээрин, анын 3 DBDден тышкаркы өз ара аракеттенишүүлөрүнүн көпчүлүгүн байкадык (Figure 5A, C).Биздин колубузда HLA-A ядродо локализацияланган (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес) жана H2B жана HMGA1 ядродо да бар экенин эске алганда, бул өз ара аракеттенүү ядродо болушу мүмкүн.H2B, HLA-A жана HMGA1 ортосунда өлчөнгөн өзгөчө кошумчалар 5D-сүрөттө көрсөтүлгөн.
HLA-Анын башка белоктор менен өз ара аракеттенүүсү анын α1 жана α2 домендеринде жана бузулган С-терминал доменинде болот (6-сүрөт).Ушул мисалдардын биринде Хла-Терминалдык N-Терминалдык Н-Терминалдык куйруктуу куйруктары менен өз ара аракеттенүү (6a, d).LRCH4 TLR4 активдештирүүнү жана LPS Cytokine индукциясын жөнгө салат, ошондо тубаса иммундук жоопту модулациялоо60,61.Бул тогуз лейцинге бай кайталануучу (LRRs) жана анын ectodomain бир calmodulin (CH) гомология мотив менен мембраналык белок, андан кийин трансмембраналык домен (TMD) 60, 62.CH домендери белок-белок өз ара 60 ортомчу деп билдирди.Лрр менен Чомандын ортосундагы 300гө жакын аминокислотанын болжолдуу бөлүгү салыштырмалуу жеткиликтүү, бирок тартипсиз.Бөлмө-протеин тармактарынын медиаторлорунун жана везикулярдык транспорттун медиаторлорунун негизинде 63-беттик транспорттун жарым-жартылай базалык региондордо бир топ протеиндин өз ара аракеттенүүсү бар экендигин байкадык.H2B негизинен CH домен менен байланышкан, ал эми MDN1 менен өз ара LRR1, LRR6, CH домендерди жана кокус аймактарды камтыган белоктун узундугу боюнча бөлүштүрүлгөн (сүрөт. 6A, B).Белгилей кетчү нерсе, өз ара аракеттенүүлөрдүн бири да TMJди камтыган, бул CLMS мамилесинин өзгөчөлүгүн сунуштайт (Figure 6A, B).
MDN1 да HLA-A протеин тармагынын бир бөлүгү катары аныкталган (Figure 6A).Ал белоктордун AAA үй-бүлөсүнө (ар түрдүү иш-аракеттер менен байланышкан ATPases) кирет.Бул ошол эле N-терминал AAA домени, ал гексамердик шакекчеге айланат жана 60S 64 рибосомалык суббирдиктен монтаждык факторду алып салат.dynein64,65,66 окшош окшойт.Мындан тышкары, Asp/Glu бай аймак MIDAS домени (металл ион көз каранды сайт) менен коштолот.MDN1 чоң өлчөмүнөн (болжол менен 5600 аминокислоталар) жана анын жакшы изилденген белоктор менен чектелген гомологиясынан улам, анын түзүлүшү жана адамдардагы функциясы жөнүндө аз маалымат белгилүү.Биз HLA-A, H2B жана LRCH4 MDN1 байланыштыруучу өнөктөштөр катары аныктадык жана алардын багытын PyMolдагы протеин комплекстери катары ачтык (сүрөт 6A, B).Бул үч протеин AAA домени, dynein сымал байланыштыргыч домен жана, балким, MIDAS MDN1 домени менен өз ара аракеттенет.Мурунку отчетто, жем протеиндердин жакындык тазалоо MDN1 гистон H2B67 менен байланышкан протеин катары аныкталган.Кошумчалай кетсек, жакында жүргүзүлгөн изилдөө HCT116 клеткаларындагы MDN жана HLA-B ортосундагы өз ара аракеттенүүнү, жакындык менен тазаланган масс-спектрометрияны колдонуп, биздин жыйынтыктарды колдогон68 билдирди.IFNα менен дарылоо үлгүлөрүндө бул комплекстин идентификациясы интерферон сигнализациясында MDN1дин ролун сунуштайт.
HLA гендери өтө полиморфтуу болгондуктан, биз Flo-1 клеткаларынын РНК секвенирлөө маалыматтарынан HLA-A, -B жана -C карталарын секвенирлөө окууларын чыгарып алдык (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес).Тартип окууга шайкеш келген пептиддик ырааттуулуктар HLA-Aда кайчылаш байланышкан пептиддер жайгашкан аймактарда HLA-A, -B жана -C ортосунда олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү (сүрөт S3).Мындан тышкары, биз H2B / HMGA1 / MDN1 / LRCH4 протеиндер менен протеин менен белок-протеинге байланышкан белок-протеинге баруу менен байланышкан эмеспиз.Бул протеиндин, MDN1, LRC1 жана HMGA1 ортосундагы протеин өз ара аракеттенүүсү HLA-бир конкреттүү экендигин билдирет.Мындан тышкары, кайчылаш эмес үлгүлөрдүн протеомикалык анализи (таблица S4) HLA-A HLA-B же HLA-C менен салыштырганда ырааттуулугу жогору экенин көрсөттү.HLA-A үчүн аныкталган пептиддер IFNα менен иштетилген жана тазаланбаган үлгүлөрүндө жогорку интенсивдүүлүккө ээ болгон.
Бул жерде аныкталган өз ара аракеттешүүлөр эки протеиндин жакын мейкиндикте спецификалык эмес кайчылаш байланышынан улам болбогондугун камсыз кылуу үчүн, биз кошумча иммунопреципитациялык анализдерди жүргүзүү менен эки жаңы HLA-A өз ара аракеттенүүчү факторлорун тастыктадык.Эндогендик MDN1 жана H2B менен HLA-A өз ара аракеттешүүсү IFNα менен дарыланган жана тазаланбаган Flo-1 клеткаларында да аныкталган (Figure 7, Figure S4).Иммунопрепреитраттардын H2B тарабынан туткунга алынганын жана бул бирикменин бузулбаган клеткалардан иммунопрепитита үлгүлөрүнө киргенден кийин IFNα дарылангандыгына байланыштуу экендигин тастыктадык (сүрөт 7а).Бирок, биздин маалыматтар IFNα дифференциалдуу HLA-A H2B жана MDN1 менен байланышты жөнгө салат деп болжолдойт.IFNα H2B жана HLA-A ортосундагы байланышты жаратат, бирок анын MDN1 менен байланышын азайтат.MDN1 HLA-A менен байланышкан деп табылып, IFN® MDN1 индукциясынан көзкарандысыз өз ара аракеттенүүнү кыскартканын байкадык (IFNE) IFNα (7bМындан тышкары, HLA-A иммунопреципитациясы A549 клеткаларында H2B басып алды (сүрөт. S4), бул өз ара аракеттенүү клетканын түрүнөн көз каранды эмес экенин көрсөтүп турат.Бирге алганда, бул натыйжалар H2B жана MDN1 менен HLA-Aнын интерферон ортомчу өз ара аракеттенүүсүн колдойт.
HLA-A H2B жана MDN1ди бирге тазалайт.Өкүл эндогендик H2B (A) жана MDN1 (B) иммуноблоттору IFNα менен дарыланган Flo-1 клеткаларынан иммунопреципитацияланган жана көрсөтүлгөн антителолор үчүн текшерилген.Чычкан жана коён IgG терс башкаруу катары колдонулган.(C) Ар түрдүү антигендердин салыштырмалуу өлчөмдөрү (киргизүү) көрсөтүлгөн антителолорго каршы текшерилген иммуноблоттор тарабынан сүрөттөлөт, жүктөө контролу катары β-актин колдонулган.
H2B-HLA-A-HMGA1, интерферон менен шартталган абдан ишенимдүү кайчылаш байланыш тармактарынын биринин структуралык касиеттери изилденген.Бул комплекске катышкан протеиндердин татаал динамикасын түшүнүү үчүн молекулярдык динамика моделин колдондук (8-сүрөт).CLMS маалыматтарынан алынган корутундулар H2B, HLA-A жана HMGA1 белокторунун ар кандай конформацияларынын мүмкүнчүлүгүн сунуштайт.Ошондуктан, төмөнкү потенциалдуу комплекстер эритүүчү чөйрөдө моделдешти: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A жана H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Монреал, Квебек, Канада) пакетин колдонуу менен баштапкы белок-белок док экраны бул белоктордун ортосунда айырмаланган мүмкүн болгон конформацияларды сунуш кылды (сүрөт 8A).Док протеин комплексинин визуализациясы бир нече өз ара аракеттенүүнү жана мүмкүн болгон конформацияларды көрсөттү (Figure 5A, 8).Ошентип, бир мүмкүн болгон конформация 8А-сүрөттө (белгиленген кайчылаш шилтемелер менен) көрсөтүлгөн жана ал андан ары MD моделдөө түтүгү аркылуу бааланган.Кошумчалай кетсек, H2B же HMGA1дин HLA-A менен байланышы HLA-A үчүн H2B жогорку жакындыгын баса белгилейт (сүрөт 8A).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A жана H2B-HLA-A-HMGA1 комплекстеринин ортосундагы мүмкүн болгон тармактардын конформациялык динамикасы.(A) Сол панель интрамолекулярдык (кызыл) жана молекулалар аралык (көк) кайчылаш байланыштардын 2D картасы (SIM-XL программалык камсыздоосунда түзүлгөн) (кайчылаш шилтеменин кесилиши 3,5ке коюлган).Мындан тышкары, аныкталган кайчылаш байланыш калдыктары H2B, HLA-A жана HMGA1 белокторунун структураларында белгиленет.Бул белоктордун тиешелүү конформациялары MOE пакетинде ишке ашырылган док түтүгү аркылуу алынган.Төмөнкү сол панелде H2B-HLA-A жана HMGA1-HLA-A комплекстеринин ар кандай мүмкүн болгон конформациялары протеин-белок менен байланышы ар түрдүү (GBVI/WSA dG; ккал/моль) көрсөтүлгөн.(B) Ар бир белок структурасы үчүн атомдук позициялардын (сутек атомдорун кошпогондо) стандарттык четтөөсү (RMSD).(C) Узактыгы ≥ 10 ns өзгөчө өз ара аракеттенүүлөрдү эске алуу менен ар кандай окшоштурулган комплекстерден молекулалар аралык белок-белок суутек байланыштары.h-байланыш донордук-акцептор кесүү расстояние 3,5 Å, ал эми донор-H-кабыл алуу бурчу ≥ 160 ° -180 ° үчүн белгиленген.(D) HLA-A-H2B жана HLA-A-HMGA1 комплекстеринен алынган ≥ 20 нс камтыган HLA-A протеин-белок өз ара аракеттенүүсүн түзгөн энбелгиленген калдыктар.Протеин структуралары 100 ns MDS орточо түзүмүн билдирет.(E) HLA-A-H2B жана HLA-A-HMGA1 комплекстеринин ортосундагы өз ара аракеттешүүлөр, эки пептиддердин ортосундагы K же S өз ара аракеттенүү сайтынын негизинде 100 нс ашуун H2B-HLA симуляциясы менен байкалган өз ара аракеттенишүүлөр.Комплексы / HMGA1-HLA-A / H2B-HLA-A-HMGA1.Кайчылаш байланыштарды баалоо үчүн чектик маани 3.0 болуп коюлуп, ≥ 10 ns алуу менен MDSтен белгилүү өз ара аракеттенүүлөр эске алынган.Белок структуралары BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) жана Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) пакеттерин колдонуу менен көргөзүлгөн.
HLA-A молекулаларынын убакыттын өтүшү менен туруктуулугу (стандарттык четтөө; RMSD же стандарттык четтөө; RMSF) комплекстерде H2B же HMGA1 белокторунун болушу HLA-Аны турукташтырганын көрсөттү (Figure 8B, Figure S5).HMGA1 протеин HLA-A B2M сайтына тыгыз байланышып, HLA-A-HMGA1 же H2B-HLA-A-HMGA1 комплексиндеги HLA-A аминокислоталарынын туруктуулугун индукциялайт (сүрөт 8B, S5 сүрөт).атап айтканда, HLA калдыктары ~60-90 жана ~180-210 H2B катышуусунда анча ийкемдүү эмес экендиги аныкталган (8B-сүрөт).H2B жана HMGA1 H2B-HLA-A-HMGA1 комплексиндеги HLA-A менен H2B же HMGA1 менен гана байланышууга салыштырмалуу жакшыраак байланышты көрсөттү (Figure 8C, D; S5 таблица).Суутектин байланыштары менен алектенген калдыктар (MD Modled Model)Ишенимдүүлүк (8E-сүрөт).CLMS жана MD моделдөөдө HLA-A калдыктары болжол менен 190-210 жана болжол менен 200-220 аминокислоталардын H2B жана HMGA1ди байланыштырары аныкталган (сүрөт 8E).
Белок-белок өз ара аракеттенүүлөрү белгилүү бир дүүлүктүрүүчүлөргө жооп катары клетка ичиндеги байланышка ортомчу динамикалык структуралык тармактарды түзөт.Көптөгөн протеомикалык ыкмалар протеиндин жалпы стабилдүү деңгээлиндеги өзгөрүүлөрдү аныктагандыктан, белок-белок өз ара аракеттенүү динамикасы байланыш интерфейстерин басып алуу үчүн кошумча куралдарды талап кылат жана CLMS ушундай инструменттердин бири болуп саналат.Интерферон сигнал берүү системасы клеткаларга интерферон-индукциялануучу белоктордун чакан топторунун индукциясы менен аяктап, айлана-чөйрөнүн патогендик жана ички патологиялык сигналдарынын спектрине жооп берүүгө мүмкүндүк берген цитокиндик тармак болуп саналат.Биз жаңы протеин менен протеиндин өз ара аракеттенүүсүн интерферон-индукцияланган белоктордун панелинен аныктоого мүмкүн экендигин аныктоо үчүн CLMS колдондук.Интерферонго жооп берүүчү Flo-1 клетка моделиндеги глобалдык протеин кайчылаш талдоо белок комплекстерин кармоо үчүн колдонулган.Кайчылаш эмес жана кайчылаш байланышкан клеткалардан трипттик пептиддердин алынышы пептиддерди эсептөөгө, жолду байытууга жана аныкталган LFQ интенсивдүүлүгү менен пептиддердин узундугун бөлүштүрүүгө мүмкүндүк берет.КАНОНИКАЛЫК ИНФОЛЕР МЕНЕН МРЕДИТ ПАКУЛНАСЫНДАГЫ ПОСТИКАЛЫК ИЧКИ КОНКЕРТҮҮЛҮК, МХХ1, UP18, OAS3 жана STOT1 сыяктуу каноникалык карама-кесилишкен протеиндердин жаңы контролук жана местационерекулярдык белокторду чагылдырган.Функционалдык чөйрөлөрдөгү ар кандай структуралык өзгөчөлүктөр жана өз ара байланыштар изилденген.
HLA-A, MDN1 жана H2B ортосундагы өз ара аракеттенүү IFNα менен дарыланган жана иштетилбеген Flo-1 жана A549 клеткаларында иммуноблотинг аркылуу аныкталган.Биздин натыйжалар HLA-A комплекстери H2B менен IFNα көз каранды экенин көрсөтүп турат.Биздин ишибиз бул эки комплекстин ко-локализациясын мындан ары чалгындоо учун кызыктуу багыт болуп саналат.Ошондой эле клетка-түрү көз карандысыз interferon-арачы протеин өз ара аныктоо үчүн клетка линияларынын панелине CLMS мамилени кеңейтүү үчүн кызыктуу болмок.Акыр-аягы, биз H2BFS-HLA-A-HMGA1 комплексине катышкан белоктордун конформациялык динамикасын түшүнүү үчүн альтернативалуу ыкма катары MD моделин колдондук, ал интрамолекулярдык жана молекулалар аралык кайчылаш сүйлөшүүлөргө көз салдык.CLMS маалыматтарынан алынган корутундулар H2BFS, HLA-A жана HMGA1 белокторунун ар кандай конформацияларынын мүмкүнчүлүгүн сунуштайт.Бул док протеин комплекстеринин ортосундагы мүмкүн болгон ар кандай конформациялар CLMS маалымат топтомунда байкалгандай бир нече өз ара аракеттенүүнү көрсөттү.Биздин методдун негизги күчтүү жактарынын бири, ал HLA сыяктуу өз ара аракеттенүүчү жогорку полиморфтук гендерди оңой аныктоого мүмкүндүк берет, ошондуктан HLA-гаплотип-спецификалык протеиндердин өз ара аракеттенүүсүн изилдөө кызыктуу болот, аларды изилдөө кыйын.Чогуу алганда, биздин маалыматтар CLMS интерферон-индукцияланган сигнал тармактары жөнүндө түшүнүгүбүздү кеңейтүү жана шишик микрочөйрөсүндөгү татаал клетка аралык системаларды изилдөө үчүн негиз болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Flo-1 клеткалары ATCC алынган жана 1% пенициллин / стрептомицин (Invitrogen), 10% түйүлдүктүн сывороткасы (Gibco) менен толукталган DMEM (Gibco) сакталган жана 37 ° C жана 5% CO2 сакталган.Инкубация.Клеткалар IFNα14 (Эдинбург протеин өндүрүшү тарабынан өндүрүлгөн) менен дарылоодон мурун 70-80% кошулмасына чейин өстүрүлгөн.Башкасы белгиленбесе, бардык башка химиялык заттар жана реагенттер Sigma Aldrich компаниясынан сатылып алынган.
Flo-1 клеткалары 6 көзөнөктүү плиталарда өстүрүлгөн жана кийинки күнү клеткалар 10 нг/мл IFNα14 менен 24 саат бою болжол менен 80% кошулганга чейин дарыланган.Клеткалар PBS менен үч жолу жууп, жаңы даярдалган DSS (Thermo Fisher Scientific) (DMSO менен эриген) PBS менен 37°Cде 5 мүнөт 0,5 мМ акыркы концентрацияга чейин байланган.DSS кайчылаш реакциясы PBS менен алмаштырылды жана DSS калдыгы 37°Cде 15 мүнөткө PBSте 20 mM Tris (рН 8.0) кошуу менен өчүрүлдү.Клеткалар кырып чогултулуп, аз байланыш түтүктөрүндө (Аксиген) чогултулган.
Клетка таблеткалары 300 мкл мочевина лизис буфери (8 М мочевина, 0,1 М Tris, pH 8,5) менен 30 мүнөткө бөлмө температурасында, анда-санда чайкап, лизистелген.Бардык центрифугалоо кадамдары 14000 xg 8°Cде аткарылды.Лизатты 10 мүнөт центрифугалап, супернатантты жаңы түтүккө өткөрүңүз.Калган тунук бөлүкчөлөр 150 мкл экинчи лизис буферинде (2 М мочевина, 2% (салм/көлөм) SDS (натрий додецил сульфаты)) бир тектүү суулуу эритме алынганга чейин 30 мүнөт же андан көп эриди.Лизат 20 мүнөт центрифугада жана үстүнкү зат мурунку кадамда алынган лизат менен аралаштырылды.Протеин концентрациялары микропластинка процедуралары боюнча өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык Micro BCA анализи (Thermo Fisher Scientific) аркылуу бааланган.Үлгүлөр тез суюк азотто тоңдурулган жана -80°Cде сакталган.
Болжол менен 100 мкг эрүүчү кайчылаш протеин, Wisniewski et al.69 Кыскача айтканда, протеин 200 мкл карбамид буфери (8 М карбамид 0,1 M Tris, рН 8,5) менен кайчылаш байланышта, вортекстелет жана эки эсеге кыскарат.Бардык центрифугалоо кадамдары 14000 xg 25°Cде аткарылды.Кайчылаш байланышкан протеин лизатынын биринчи жарымы Ultracel-10 мембранасы (Merck) менен жабдылган 10 кДа Микрокон борбордон тепкичтүү фильтр аппаратына өткөрүлүп, андан кийин фильтрде 25 мүнөт центрифугалоо жүргүзүлдү.Андан кийин протеиндин экинчи жарымын чыпкага кошуп, ошол эле кадамдарды кайталаңыз.Протеинди калыбына келтирүү мочевина буферине 100 мкл 17 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлоридин (TCEP) кошуу менен аткарылды.Калыбына келтирүү термомиксерде 600 айн/мин 30 мүнөт 37°Сте аралаштырылды.Мындан тышкары, мамычаны центрифугалашты жана кыскартылган кайчылаш байланышкан протеин карбамид буферинде 100 мкл 50 мМ йодоацетамидди колдонуу менен алкилдештирди.Алкилдөө реакциясы бөлмө температурасында 20 мүнөт бою караңгы жерде өткөрүлдү.Колонканы айлантып, колонналардын дубалдарын 3 жолу 100 мкл карбамид буфери менен жууп, андан кийин центрифугалоо.Ушул эле операция 100 мкл 100 мм аммоний бикарбонатын колдонуу менен 3 жолу жасалды.Трипсинациядан мурун чогултуу түтүгүн жаңысына алмаштырыңыз.50 мМ аммоний бикарбонатын жана трипсин буферинде (Промега) суюлтулган 1 мкл трипсинди камтыган сиңирүү буферин кошуңуз.Трипсиндин протеинге болгон катышы болжол менен 1:33 деңгээлинде сакталып, сиңирүү реакциялары түнү бою нымдуу камерада 37°С температурада инкубацияланган.Кайчылаш байланышкан пептид 25 мүнөткө центрифугалоо жолу менен фильтрден чыгарылды.Пептиддерди калыбына келтирүү фильтрге 50 мкл 0,5 М NaCl кошуп, андан кийин 25 мүнөт центрифугалоо аркылуу жакшыртылды.
C18 Micro Spin мамычалары (Гарвард аппараты) Bouchal et al.70 тарабынан сүрөттөлгөн протоколго ылайык кайчылаш байланышкан триптикалык пептиддерди тузсуздандыруу үчүн колдонулган.Кыскача айтканда, C18 спиндик мамычалар ацетонитрилдеги (AcN) (Merck) 0,1% кумурска кислотасын (FA) үч жолу жуу жана 0,1% FA эки жолу жуу менен активдештирилди.Колонна 15 мүнөткө 0,1% FA менен гидратталган.Үлгүлөрдү айланма тилкелерге жүктөө жана 0,1% FA менен 3 жолу жуу.Тузсуздандырылган пептиддер 0,1% FAдагы 50%, 80% жана 100% AcN колдонуу менен баскычтуу градиент менен ырааттуу элюцияланган.Үлгүлөр SpeedVac Plus концентраторунда (Эппендорф) калдык суюктук толугу менен жок болгонго чейин кургатылган.Элюталанган пептиддер 100 мкл 0,08% trifluoroacetic кислотасынын 2,5% AcN менен эриди жана концентрациялары NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) менен өлчөнөт.LC-MS/MS системасына ар бир үлгүгө болжол менен 1 мкг кайчылаш пептид куюлган.
Кайчылаш байланышкан пептиддер UltiMate 3000 RSLCnano LC системасында (Thermo Scientific) Orbitrap Exploris 480 масс-спектрометрине (Thermo Scientific) туташтырылган.Кайчылаш байланышкан пептиддер C18 PepMap100 сорбенти жана 5 мкм PepMap сорбенти (Thermo Scientific) менен таңгакталган 300 мкм ID, 5 мм узундуктагы μ-мамычага чейинки C18 басып алуу тилкесинде чогултулган.Насостун агымын 5 мкл/мин 2,5% AcN менен эриген 0,08% trifloroacetic кислотасы менен жүктөңүз.Кайчылаш байланышкан пептиддер 2 мкм PepMap сорбенти (Thermo Scientific) менен толтурулган ички диаметри 75 мкм жана узундугу 150 мм болгон аналитикалык эритилген кремнеземдик колонкада бөлүнгөн.А жана В кыймылдуу фазалары тиешелүүлүгүнө жараша суудагы 0,1% FA жана ацетонитрилдеги 0,1% FAдан турган.Градиент 2,5% Bдан башталат жана 90 мүнөттүн ичинде сызыктуу түрдө 40% Bга, андан кийин кийинки 2 мүнөт ичинде 90% Bга чейин көбөйөт.Мобилдик фазалык курамы 10 мүнөт бою 90% В деңгээлинде сакталып, андан кийин 2 мүнөттүн ичинде сызыктуу түрдө 2,5% В чейин төмөндөгөн.Колонна кийинки циклге чейин 8 мүнөткө 2,5% В тең салмактуу болгон.Аналитикалык колонкадан алынган кайчылаш байланышкан пептиддер наноэлектроспрей иондоштуруу (NSI) булагында иондоштурулган жана Exploris 480 масс-спектрометрине (Термо Илимий) сайылган.
Orbitrap Exploris 480 масс-спектрометри позитивдүү маалыматтар корреляция режиминде иштеген.Толук сканерлөө m/z 350 Th дан m/z 2000 Th чейин диапазонун орнотуулары менен 120 000 токтому менен секциялык режимде аткарылган.Нормалдаштырылган AGC максаты 50ms максималдуу киргизүү убактысы менен 300% белгиленген.Пептиддер үчүн моноизотоптук чокуларды аныктоо белгиленген.Өтө аз прекурсорлор табылса, чектөө релаксация параметри чындыкка коюлат.Прекурсордун минималдуу иондук күчү 5,0e3 болуп коюлуп, прекурсордун зарядынын +8ге чейинки абалы эксперименттерге киргизилген.
Маалыматтарды корреляция режиминде негизги сканерлөөнүн ортосундагы цикл убактысы 2,5 секундга белгиленген.Динамикалык массаны алып салуу прекурсор ионунун биринчи фрагментациясынан кийин 20 секундга белгиленген.Прекурсорду изоляциялоо терезеси 2 Th.Кагылышуунун белгиленген энергия режими менен нормалдаштырылган кагылышуу энергиясынын түрү маалыматтарга көз каранды MS/MS сканерлөөсүндө тандалган.Кагылышуу энергиясы 30% га чейин коюлган.Orbitrap резолюциясы 15 000 жана AGC максаты 100% деп белгиленген.Ыңгайлаштырылган максималдуу инъекция убактысы 60 миллисекундга коюлган.
Кайчылаш байланышкан үлгүлөрдөгү протеин-белок тармагын көзөмөлдөөдөн мурун, биз үлгүлөрдөгү байкоого боло турган пептиддерди/белоктарды аныктоо үчүн MaxQuant пакетин (1.6.12.0 версиясы) 26,27 колдонуп чийки файлдарды иштеттик.Мындан тышкары, окшош протеомикалык анализдер IFNα менен мамиле кылынган жана иштетилбеген Flo-1 үлгүлөрүндө аткарылган.MS/MS маалыматтары UniProt адамдын маалымат базасында (www.uniprot.org) изделген (2020-жылдын 12-августунда жүктөлгөн, 75 093 жазууну камтыйт) Andromeda27 орнотулган издөө системасынын жардамы менен.Издөө ферменттин өзгөчөлүгүн жана деамидалануунун (N, Q) жана кычкылдануунун (М) ар кандай модификацияларын көрсөтпөстөн жүргүзүлгөн.Прекурсордун массасынын толеранттуулугу 20 промилледе жана продукт иондору 0,02 Дада белгиленген.баштапкы жана максималдуу массалык четтөө 10 ppm белгиленген.Пептиддин максималдуу массасы 4600 Да белгиленген жана ырааттуулук окшоштугу 7 жана 25 аминокислота (аа) ортосунда белгиленген.Андан аркы статистикалык талдоо Perseus программасын (1.6.10.45 версиясы) колдонуу менен жүргүзүлдү.Протеиндин мазмуну протеиндин спектралдык интенсивдүүлүгүн нормалдаштыруу жолу менен эсептелген (LFQ интенсивдүүлүгү; белгиленбеген сандык көрсөткүч)27 жана интенсивдүүлүктүн маанилери Log2ге айландырылган.Алардын пептиддик интенсивдүүлүгү менен аныкталган белоктордун иерархиялык кластери R (v 4.1.2) ичиндеги pheatmap (v1.0.12) пакетин колдонуу менен курулган.Жолду байытуу талдоо IFNα менен дарыланган протеиндер үчүн Reactome жол маалымат базасын колдонуу менен жүргүзүлдү, алар тазаланбаган үлгүлөргө салыштырмалуу төрт эседен ашык активдешти.
LC-MS/MS тарабынан көзөмөлдөнгөн белок комплекстеринин лизин (K) же сериндик (S) өзгөчө химиялык кайчылаш байланыштарын аныктоо кайчылаш байланышкан пептиддердин (SIM-XL) 29 үчүн спектроскопиялык идентификациялоочу машинаны (SIM-XL) колдонуу менен аткарылган.Биринчиден, интерферон-байланышкан (IFN) ДНКнын бузулушунун колу (IRD) гендер (IRD) гендер Падария жана Ал.28де сүрөттөлгөн IRDS протеиндик маалымат базасын колдонуп иликтөө жүргүзүлдү.Бүткүл адамдын бардык шарттарын жана кайталоолордун кайталанышы бир кыйла бирдиктүү түрдө интенсивдүү, ошондуктан бүт адамдык белгисиз маалыматтар базасы (www.Uniprot.org) (12-август 2020-жылы 12-августтан слотт!Жогорку ишенимдүү өз ара аракеттенүү үчүн чыпкалардын бири.Алынган бул жогорку маанидеги өз ара аракеттенүүлөр кеңейтилген жана бардык кайталоодо жана шарттарда сыналган.
SIM-XLде, DSS кросслинкер (XL) үчүн колдонулган жана XL салмактын жылышы жана өзгөртүү салмагынын жылышы тиешелүүлүгүнө жараша 138,06 жана 156,07ге коюлган.Төмөнкү кайчылаш байланыш реакцияларынын участоктору каралат: KK, KS жана KN-TERM, кабарчы иондору жок.Эки прекурсор жана фрагмент ppm 20 жана Xrea босогосу 0,15ке белгиленген.Трипсин толугу менен спецификалык деп эсептелип, жогорку энергиялуу С-капкан (HCD) фрагментация ыкмасы ишке ашырылган.XCorr динамикалык МБ кыскартуу босогосу жана динамикалык МБ кыскартуу үчүн пептиддердин минималдуу саны тиешелүүлүгүнө жараша 2,5 жана 2 болуп коюлган.Башка параметрлер: моноизотоптун ыктымалдыгы жана эң жогорку кокустуктун кесилиши, бир жипте минималдуу 4 АА калдыктары жана жиптин максималдуу заряды жана өткөрүлбөй калган бөлүнүүлөрдүн 3 максимасы.Натыйжада тигилген 2D карталары (SIM-XL) талданган жана 2D карталарын түзүү үчүн xQuest28 графикалык өкүлчүлүгү колдонулган.Протеин структуралары боюнча протеин кайчылаш байланыштары PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, версия 2.0 Schrödinger, LLC) менен камсыз кылынат.
Протеин моделинин структуралары Phyre2 серверинин (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 гомологиялык моделдөө принциптерин колдонуу менен жана “Жашыруун Марков методун” ишке ашыруу менен түзүлгөн.Phyre2 белгилүү протеин структуралары менен ырааттуулукка негизделген моделдик структураларды түзөт.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 жана MDN1 белоктору үчүн 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 жана 6i2665 үлгү структуралары колдонулган.Мындан тышкары, AlphaFold71 MX1, UBP18 жана ROBO1 түзүмү да каралды.Белоктун түзүлүшү BIOVIA Discovery Studio Visualizer пакети (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан-Диего, CA, АКШ) жана Молекулярдык Иштөө чөйрөсү пакети (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада) аркылуу визуализацияланган.