ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплекстүү ширетилген түтүк Химиялык өнөр жай химиялык компоненти, SPECC1L жетишсиздиги бириктирилген муундардын туруктуулугун жогорулатат жана баш мээнин нерв клеткаларынын төгүлүшүн азайтат.

Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат.Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз.Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү).Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Химия өнөр жайы үчүн дуплекстүү ширетилген түтүк

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.дат баспас болоттон жасалган кемчиликсиз түтүктөргө, жаркыраган күйдүрүлгөн түтүктөргө, тиксиз ширелүү түтүктөргө жана башкаларга адистешкен алдыңкы өндүрүүчүсү.Кардарларды жеңилдетүү үчүн бизде ширетилген түтүктөр жана түтүктөр да бар.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.абдан өнүккөн өндүрүү жана сыноо жабдуулары бар.Биз сиздин талабыңызды толугу менен канааттандыра алабыз.Стандартка ылайык, биз чыгарган түтүктөр ар дайым туура OD жана WT сабырдуулугуна ээ.Сабырдуулукту көзөмөлдөө стандарттарды өндүрүүгө катуу ылайык келет.Биздин продуктылар ар дайым кардарлар менен канааттандырылат.Биздин өнүмдөрдү сатып алган кардарлар көбүрөөк пайда алып келишти.
а) OD (тышкы диаметри): 3,18 ммден 101,6 ммге чейин
б) WT (дубал калыңдыгы): 0,5 ммден 20 ммге чейин
в) Узундугу: кардардын талабы боюнча
г) Стандарттар: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ж.б
д) Процесс ыкмасы: ERW, EFW ж.б

Ар бир слайдда үч макала көрсөтүлгөн слайдерлер.Слайддар аркылуу өтүү үчүн артка жана кийинки баскычтарды же ар бир слайд аркылуу жылуу үчүн аягындагы слайд контроллер баскычтарын колдонуңуз.
Крандык нерв кыртыш клеткалары (CNCC) түйүлдүктүн нейрон бүктөмдөрүн жарып чыгып, ортоңку бет структураларынын көбүн түзгөн фарингалдык аркаларга көчүшөт.CNCC дисфункциясы оозеки жырыктын этиологиясында маанилүү ролду ойнойт, жалпы тубаса кемтик.Гетерозиготалуу SPECC1L мутациялары атиптик жана синдромдук жаракалар менен ооругандарда табылган.Бул жерде биз канондук жабышчаак түйүндөрдүн (AJ) компоненттеринин, β-катениндин жана Е-кадериндин SPECC1L кулатуучу клеткаларындагы жакшыртылган боёгу жөнүндө кабарлайбыз жана электрондук микросүрөттөр AJ апикалдык-базалдык диффузиясын көрсөтөт.Краниофациалдык морфогенездеги SPECC1L ролун түшүнүү үчүн биз Specc1l жетишсиз чычкан моделин түздүк.Гомозиготалуу мутанттар эмбриондук өлүмгө алып келет жана нерв түтүгүнүн жабылышын жана CNCC ламинациясын көрсөтөт.Мутанттык нейрон бүктөмдөрүндө AJ протеининин боёлушу көбөйөт.Бул AJ кемчилиги AJ эритүү талап кылынган CNCC деламинациясынын кемчилиги менен шайкеш келет.Мындан тышкары, Specc11 мутанттары PI3K-AKT сигнализациясын азайтып, апоптозду көбөйттү.In vitro, жапайы типтеги клеткалардагы PI3K-AKT сигналынын жумшак ингибициясы AJ өзгөрүүлөрүн индукциялоо үчүн жетиштүү болгон.Маанилүү нерсе, SPECC1L кулатуусу менен шартталган AJ өзгөрүүлөр PI3K-AKT жолун активдештирүү менен артка кайтарылышы мүмкүн.Чогуу алганда, бул маалыматтар SPECC1L PI3K-AKT сигнализациясынын жана AJ биологиясынын жаңы жөнгө салуучусу катары нерв түтүгүн жабуу жана CNCC стратификациясы үчүн талап кылынарын көрсөтүп турат.
Баш мээнин нейроэктодермасынын клеткалары (CNCCs) арка нейроэктодермага локализацияланат жана эпителий-мезенхималык өтүү (EMT) 1,2,3 процесси аркылуу өнүгүп келе жаткан нейроэпителийден ажырайт.Премиграциялык эпителийдик CNCCs клеткалар аралык кошулмаларды бузуп, биринчи жана экинчи фарингалдык аркаларды толтурган жана баш-бет кемирчектин көпчүлүк бөлүгүн түзгөн миграциялык мезенхимдик CNCCге айланат.Ошентип, CNCC функциясын жөнгө салуучу гендер көбүнчө АКШда 1/800 төрөлгөндөрдүн 1/800 төрөтүнө таасир этүүчү орофасалдык жаракалар сыяктуу краниофациалдык тубаса аномалиялардын этиологиясында көп бузулат.Тубаса кемтиктердин бири8.
CNCC деламинациясы чычкандардын эмбриондук өнүгүүсүнүн 8,5 жана 9,5 күн аралыгында алдыңкы нерв түтүгүнүн жабылышы менен дал келет.Чычкандардын оро-бет жырыгы менен байланышкан бир катар гендердин мутанттары нерв түтүкчөлөрүнүн кемчилигинин кандайдыр бир түрүн көрсөтөт, анын ичинде Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 жана Pdgfrα12.Бирок, нерв түтүгүн жабуу жана CNCC стратификация процесстерин көз карандысыз деп эсептесе болот, анткени Splotch мутант чычкан (Pax3) CNCC стратификациясына же миграциясына эч кандай таасири жок нерв түтүгүн жабууда кемчиликтерди көрсөтөт 13,14.CNCC диссекциясында жана нерв түтүгүн жабууда кемчиликтери бар чычкандын кошумча моделдери бул эки процесстин жалпы молекулярдык негизин аныктоого жардам берет.
Нейроэпителиалдык клеткалардан CNCC изоляциясы актин жипчелери менен байланышкан E-cadherin, β-катенин, α-E-катин жана α-актинин камтыган белок комплекстеринен турган жабышчаак түйүндөрдүн (AJs) эришин талап кылат 2 Нейрондук бүктөмдөрдөгү E-cadherinдин ашыкча экспрессияны изилдөөлөрү CNCC деламинациясынын азайгандыгын же кечиктирилгенин көрсөттү.Тескерисинче, E-cadherin бөгөт коюу эрте stratification15,16 алып келет.CNCC стратификациясында EMT ортомчу факторлордун көбү транскрипция факторлору (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) жана матрицалык металлопротеиназалар (MMPs) сыяктуу клеткадан тышкаркы матрицаны (ECM) кайра түзүүчү протеиндер, бирок CNCCs түз цитоскелеттер AJ болуп саналат. азырынча белгисиз.PI3K-AKT жолу, негизинен, рак изилдөөлөр17, E-cadherin көлөмүн каршы белгилүү.Акыркы изилдөөлөр чычкандардын PDGFα негизиндеги PI3K-AKT сигналынын жоголушу краниофациалдык аномалияларга, анын ичинде таңдайдын жырыгына жана нерв түтүкчөлөрүнүн кемчиликтерине12 алып келерин көрсөттү.Бирок, PI3K-AKT жолу менен AJ туруктуулугунун CNCC стратификациясынын ортосундагы байланыш түшүнүксүз.
Биз мурун SPECC1Lди оозунан көзгө чейин созулган, кыйгач жарак (ObFC) же Tessier IV18 жаракасы деп аталган оор жаракасы бар эки адамдын биринчи мутант гени катары аныктаганбыз.SPECC1L мутациялары аутосомдук басымдуулук кылган Opitz G/BBB синдрому (OMIM №145410) бар эки көп муундуу үй-бүлөдө аныкталган, мында жабыркаган адамдар гипердистанция жана жырык эрин/таңдай19 жана Тиби ашыкча аралык синдрому бар бир үй-бүлөдө (OMIM №145420)20 .Opitz G/BBB синдрому учурларынын жарымынан көбү X-байланышкан (OMIM #300000) жана микротүтүкчөлөр менен байланышкан клетка скелетинин 22 протеинди коддогон MID1 гениндеги мутациялардан улам пайда болот.Биз SPECC1L, ошондой эле microtubules жана актин цитоскелет менен байланышкан бир белок, клетка адгезиясы жана миграция 18 учурунда актин цитоскелет кайра моделдөө үчүн зарыл болгон сигнал ортомчу болушу мүмкүн деп божомолдошот.In vitro жана in vivo изилдөөлөрүнүн жардамы менен биз азыр SPECC1Lди PI3K-AKT сигнализациясы аркылуу AJ туруктуулугунун жаңы жөнгө салуучусу катары сүрөттөйбүз.Клеткалык деңгээлде SPECC1L жетишсиздиги пан-АКТ протеининин деңгээлинин төмөндөшүнө жана AJтин апикалдык-базалдык дисперсиясынын жогорулашына алып келди, ал AKT жолунун химиялык активдешүүсү менен жок кылынды.In vivo, Specc11 жетишсиз эмбриондор нерв түтүкчөлөрүнүн жабылышынын бузулушун жана CNCC диссекциясынын кыскарышын көрсөтөт.Ошентип, SPECC1L бет morphogenesis учурунда нормалдуу CNCC иштеши үчүн талап кылынган жогорку жөнгө клетка адгезия негизделген сигналда иштейт.
клеткалык денгээлде SPECC1L ролун мүнөздөө үчүн, биз SPECC1L18 жетишсиз мурда сүрөттөлгөн туруктуу остеосаркома клетка линиясын U2OS колдонгон.SPECC1L (kd) талкаланган бул туруктуу U2OS клеткаларында SPECC1L транскрипттеринин жана белокторунун деңгээлинин орточо (60-70%) төмөндөшү, ошондой эле актин цитоскелетинин миграциясында жана реорганизациясында кемчиликтер байкалган. SPECC1L митоздук кемчиликтерди 23 алып көрсөткөн.Андан аркы мүнөздөмөлөрдөн кийин, биз туруктуу SPECC1L-kd клеткаларыбыз морфологияны өтө жогорку деңгээлде айкалыштырганын таптык (1-сүрөт).Жеке башкаруу клеткалары жана кд клеткалары аз кошулган жерде окшош көрүндү (Figure 1A, D).Бириккенден кийин 24 сааттан кийин башкаруучу клеткалар куб формасында (1В, Е-сүрөт) сакталып калган, ал эми SPECC1L-kd клеткалары узартылган (сүрөт 1С, F).Клетка формасындагы бул өзгөрүүнүн көлөмү башкаруу клеткаларынын жана kd клеткаларынын in vivo жандуу сүрөтү аркылуу тартылган (1-фильм).SPECC1Lнин кошулган клеткалардагы ролун аныктоо үчүн биз алгач анын экспрессиясын карап чыктык.Биз SPECC1L протеининин деңгээли синтезде жогорулаганын байкадык (Figure 1G), ал эми SPECC1L транскриптинин деңгээли жогорулаган жок (Figure 1H).Мындан тышкары, клетка тыгыздыгы көбөйгөн сайын, SPECC1L белок клеткалар аралык чек араларда (сүрөт 2A-E) чогулуп, мембрана менен байланышкан β-катенин (сүрөт 2A'-E') менен дал келет.SPECC1Lнин актин цитоскелети 18,23 менен байланышын эске алып, биз SPECC1L актинге негизделген жабышчаак түйүндөр (AJ) менен өз ара аракеттенет деп божомолдодук.
(AF) SPECC1L кулатуучу (DF) клеткалары башкаруучу U2OS клеткаларына (AC) салыштырмалуу жогорку кошулганда (F) узартылат.Бул жерде биз ар кандай клетка тыгыздыгы үчүн тандалган алты убакыт чекитинин үчөө (T1, T3, T6) көрсөтүлгөн.(G) SPECC1L протеининин контролдук клеткалардагы кошулуунун төмөн деңгээли менен салыштырганда жогорку даражада турукташкандыгын көрсөткөн Western Blot анализи.SPECC1Lдин батыш тагы күтүлгөн 120 кДа тилкесин жана жогорку молекулярдык салмак тилкесин, балким, котормодон кийин өзгөртүлгөн (*) көрсөтөт.Western Blot анализи төмөн жана жогорку кошулуу үчүн бирдей шарттарда аткарылган.SPECC1L төмөн жана жогорку айкалыштырууда көрсөтүлгөн сүрөттөр бир эле тактан алынган.Ошол эле так алынып, β-актин антитело менен кайра текшерилди.(H) Сандык RT-PCR талдоо SPECC1L транскрипт деъгээлинде эч кандай олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөттү.Ката тилкелери төрт көз карандысыз эксперименттердин SEMs билдирет.
(AE) Биз SPECC1L кулатуусу (kd) менен U2OS клеткаларындагы клетка формасынын анализин жана AJ өзгөрүүлөрүн нормалдаштыруу үчүн клетканын тыгыздыгынын диапазонунан алты убакыт чекиттерин (T1-T6) тандап алдык.Бул убакыт чекиттеринин биринчи бешине жалгыз клеткалар (T1), кичинекей клетка кластерлеринин 50-70% кошулушу (T2), kd клеткаларынын формасын өзгөртпөстөн биригүү (T3), kd клеткаларынын формасын өзгөртүү (T4) жана 24 сааттык өзгөрүүлөр.kd (T5) клеткаларынын арткы формасында.SPECC1L белок T1 (A) боюнча цитоплазмада басымдуу таралган, бирок анын топтолушу клетка аралык чек араларда кийинки убакыт чекиттеринде байкалган (B-E, жебелер).(FJ) β-катенин AJ комплекси менен байланышкан клеткалар аралык чектерде окшош топтоону көрсөтөт.(A'-E') SPECC1L жана β-катенин клетканын жогорку тыгыздыгында клетканын чектеринде кайталанган боёкторду көрсөтөт (жебелер).(F'-J') SPECC1L-kd клеткаларында β-катенин боёгу клетканын тыгыздыгы төмөн (F'-H') кадимкидей көрүнөт, бирок клетканын формасы өзгөргөн сайын кеңейет (I', J'; жебелер), бул AJ өзгөрдү.Барлар = 10 мкм.
Андан кийин биз SPECC1L жетишсиздигинин AJга таасирин аныктоого аракет кылдык.Биз бир нече AJ менен байланышкан маркерлерди, анын ичинде F-актин, миозин IIb, β-катенин жана E-cadherin24,25,26,27 канондук компоненттерди колдондук.Актин стресс жипчелери мурда (сүрөт. 3A, B) 18 сүрөттөлгөн SPECC1L-kd клеткаларында көбөйгөн.Актин жипчелери менен байланышкан миозин IIb in vitro SPECC1L-kd клеткаларынын окшош өсүшүн көрсөттү (сүрөт 3C, D).AJ-ассоциацияланган β-катенин клетка мембранасында кадерин менен байланышып, башкаруучу кубоциттерде кадимки "балдын" экспрессия үлгүсүн көрсөтөт (сүрөт 3E, G).Кызыктуусу, конфокалдык микроскопияны колдонуу менен жалпак сүрөттөрдө β-катенин (сүрөт 3E, F) жана E-cadherin (сүрөт. 3G, H) кошулган SPECC1L жетишсиз клеткалардын клетка кабыкчасында боёо узартылган боёктун көрүнүктүү үлгүлөрүн көрсөткөн.Kd клеткаларында AJ менен байланышкан β-катенин боёгунун бул кеңейиши кошулган жерде эң айкын болгон, бирок клетканын формасынын өзгөрүшүнө чейин көрүнгөн (сүрөт 2F-J, F'-J').Бул кеңейтилген AJ боёонун физикалык табиятын аныктоо үчүн, биз SPECC1L-kd U2OS клеткаларынын апикалдык-базалдык бетиндеги клетканын чектерин трансмиссиялык электрондук микроскопия (TEM) аркылуу изилдедик (Figure 3I, J).AJ (жебелер) көрсөткөн өзүнчө электрон жыш аймактары болгон контролдоочу клеткалардан (3I-сүрөт) айырмаланып, kd клеткалары (3J-сүрөт) апикобазалдык тегиздикте AJтин жогорку электрон тыгыздыгынын чоң, чектеш аймактарын көрсөттү..Мындан тышкары, туурасынан кеткен кесилиштерде, биз kd клеткаларында кеңири клетка мембранасынын бүктөлүшүн байкадык (сүрөт. S1A, B), бул β-катенин жана Е-кадхерин боёо тилкелеринин кеңейтилген үлгүсүн түшүндүрөт (сүрөт. 3F, H).AJs менен SPECC1L ролун колдоо үчүн, β-катенин кошулган U2OS клеткаларынын лизаттарында SPECC1L менен бирге иммунопреципитацияланган (сүрөт 3K).AJ маркерлери үчүн кеңейтилген иммуносток менен бирге, TEM анализи SPECC1L жетишсиздиги AJ апикалдык-базалдык тыгыздыгын жана дисперсиясын жогорулатат деген гипотезабызга шайкеш келген.
(AH) 48 сааттан кийин кд клеткаларында F-актин боёгу көбөйгөн (T6; A, B).F-актин (C, D) менен байланышкан миозин IIb өзгөртүлгөн боёк.Башкаруу клеткаларында (E, G) β-катенин жана E-cadherin кабыкчасынын жылмакай үлгүсү SPECC1L-kd (F, H) клеткаларында күчөтүлгөн.Барлар = 10 мкм.(I–J) Апикалдык-базалдык клеткалар аралык байланышты байкоочу электрондук микросүрөттөр.Башкаруу клеткалары жабышчаак түйүндөрдү (I, жебелер) көрсөтүүчү так электрондук жыш аймактарды көрсөтөт.Ал эми, SPECC1L-kd клеткаларындагы бүт апикалдык-базалдык кошулуу электрондук жыш (J, жебелер) пайда болуп, тыгыздыктын жогорулагандыгын жана жабышчаак түйүндөрдүн дисперсиясын көрсөтүп турат.(K) β-катенин кошулган U2OS клетка лизаттарында SPECC1L менен бирге иммунопреципитацияланган.Төрт көз карандысыз эксперименттин бирин билдирген бир жерден алынган сүрөт.
SPECC1Lнин краниофациалдык морфогенездеги ролун түшүнүү үчүн биз эки көз карандысыз ES тузак клетка линиясын, DTM096 жана RRH048 (BayGenomics, CA) колдонуп, Specc1l жетишсиз чычкан моделин түздүк, алар интрон 1 жана Specc1l транскрипттери 115 (Fig. .4A, сүрөт S2).Декоя векторунун геномдук орду бүт геномдун секвенирлөө жолу менен аныкталды жана ПТР менен ырасталды (S2-сүрөт).Эки ген тузак конструкциялары дагы Specc11-lacZ кабарчыларынын кадрдын ичинде биригишине мүмкүндүк берди.Ошондуктан, X-gal боёо менен аныкталган lacZ туюнтмасы Specc11 туюнтмасынын көрсөткүчү катары колдонулган.Эки аллель тең окшош lacZ экспрессия үлгүлөрүн көрсөттү, интрон 1деги DTM096 ген тузагы 15 интрондогу RRH048ге караганда күчтүүрөөк экспрессияны көрсөттү (көрсөтүлгөн эмес).Бирок, Specc1l кеңири чагылдырылат, айрыкча E8.5 нейрон бүктөмдөрүндө (4B-сүрөт), нерв түтүкчөлөрүндө жана E9.5 жана E10.5теги бет процесстеринде (сүрөт 4C, D) жана өнүгүп келе жаткан буттарда өзгөчө күчтүү чагылдырылган. E10до.5 жана көздөрү (сүрөт 4D).Биз мурда E10.5 боюнча биринчи фарингалдык аркадагы SPECC1L экспрессиясы эпителийде жана CNCC тукумуна шайкеш келген негизги мезенхимада18 бар экенин билдирген.CNCC менен SPECC1L туюнтма сыноо үчүн, биз E8.5 нейрон бүктөмөлөр (Figure 4E-J) жана E9.5 баш сөөгү бөлүмдөрү (Figure 4K-) аткарылган.E8.5 боюнча, SPECC1L NCC маркерлер менен боёлгон клеткаларды, анын ичинде (сүрөт. 4G, J) интенсивдүү (сүрөт. 4E, H) нейрон бүктөмөлөрдү боёп.E9.5 боюнча, SPECC1L (сүрөт. 4K, N) AP2A (сүрөт. 4L, M) же SOX10 (сүрөт. 4O, P) менен бирге боёлгон миграциялык CNCC катуу боёлуп калган.
(A) ES DTM096 (интрон 1) жана RRH048 (интрон 15) клетка клондорунда алдамчы вектордук киргизүүнү көрсөткөн чычкан Specc11 генинин схемалык көрүнүшү.(BD) Specc1l экспрессиясын билдирген гетерозиготалуу Specc1lDTM096 эмбриондорунун E8.5тен E10.5ке чейинки lacZ боёгу.NE = нейроэктодерма, NF = нерв бүктөлүшү, PA1 = биринчи фарингалдык арка.(EP) E8.5 (NF; EJ) нейрон бүктөмдөрүндө жана E9.5 (KP) баш сөөк бөлүмдөрүндө NCC маркерлери AP2A жана SOX10 менен иммуноскоюу.SPECC1L боёгу E8.5 (E, H; жебе баштары), анын ичинде AP2A (F, G; жебе баштары) жана SOX10 (I, J; жебе баштары) менен белгиленген клеткаларда нейрондук бүктөлөрдө кеңири байкалган.E9.5 боюнча, SPECC1L катуу боёлуп AP2A (L, M; жебелер) жана SOX10 (O, P; жебелер) деп белгиленген миграциялык CNCCs (K, N; жебелер).
Гетерозиготалуу Specc1lDTM096/+ менен Specc1lRRH048/+ чычкандарынын ортосунда өтүү эки ген тузак аллелдери комплементардуу эмес экенин жана ген капкан аллели үчүн кошунду гетерозиготалар менен эмбриондук гомозиготтор эмбриондук өлүмгө алып келерин көрсөтөт (таблица S1).Менделдик катыштар төрөлгөндө гетерозиготалардын жашоо көрсөткүчүнүн төмөндөшүн көрсөткөн (күтүлгөн 1,34 каршы 2,0).Биз гетерозиготтор арасында перинаталдык өлүмдүн төмөндүгүн белгиледик, кээ бирлеринде баш-бет аномалиялары бар (сүрөт S3).Бирок, бул перинаталдык краниофациалдык фенотиптердин аз кириши алардын негизги патофизиологиялык механизмдерин изилдөөнү кыйындатат.Ошондуктан, биз гомозиготалуу Specc11 мутанттарынын эмбриондук өлүмгө дуушар болгон фенотипине көңүл бурдук.
Көпчүлүк татаал гетерозиготалуу же гомозиготалуу Specc1lDTM096/RRH048 мутант эмбриондору E9.5–10.5 (сүр. 5A–D) кийин өнүккөн эмес жана нерв түтүгү алдыңкы жактан жабылган эмес (сүрөт. 5B, D) жана кээде арт жактан жабылган (көрсөтүлгөн эмес) ..Бул баш мээнин нерв түтүгүн жабуу кемчилиги E10.5 боюнча нейрондук бүктөлөрдө калган DLX2 деп белгиленген CNCC көпчүлүк бөлүгү менен байланыштуу болгон, эч кандай диссекцияны көрсөткөн (Figure 5A'-D').CNCCнин жалпы көлөмү да азайганын аныктоо үчүн, биз CNCC линияларын GFP менен Wnt1-Cre жана ROSamTmG менен ген тузак сызыктарыбызга белгилейбиз.Биз бүт эмбриондордон сорттолгон GFP+ NCC жана GFP- (RFP+) эмес NCC агымын алып жатабыз.E9.5 боюнча, агымы сорттолгон GFP-белгиленген CNCCs үлүшү нормалдуу CNCC спецификациясын көрсөтүп, WT жана мутант эмбриондор (көрсөтүлгөн эмес) ортосунда олуттуу өзгөргөн жок.Ошондуктан, биз ачык нейрон бүктөмөлөрүндө калдык Wnt1-Cre жана DLX2 боёгу (Figure 5B') SPECC1L-kd клеткаларында көрүнүп тургандай, AJ клеткаларынын тыгыздыгынын же дисперсиясынын жогорулашынан улам, CNCC катмарынын бузулушуна байланыштуу деп божомолдодук.Нейрондук бүктөмдө CNCC бар экендигин тастыктоо үчүн SOX10, AP2A жана DLX2 NCC маркерлерин колдондук (Figure 5E-R).E8.5 боюнча, бардык үч NCC маркерлер үчүн нейрон бүктөлмө боёк WT (сүрөт. 5E, G, I) жана Specc1l мутант (сүрөт. 5F, H, J) бөлүмдөрүндө байкалган.E9.5 боюнча, NCC маркерлер WT бөлүмдөрүндө көчүп NCC боёлгон, ал эми (сүрөт. 5M, O, Q), калдык NCC боёо Specc1l мутант эмбриондор (сүрөт. 5N, P, R) ачык нейрон бүктөмөлөр байкалган.SOX10 жана DLX2 миграциялык CNCCлерди белгилешкендиктен, бул натыйжа SPECC1L жетишсиз CNCCлер миграциядан кийинки спецификацияга жетишет, бирок нейрон бүктөмөлөрүнөн көчүп кете албайт.
Specc11 жетишсиздиги нерв түтүкчөлөрүнүн бузулушуна, баш мээнин нерв кыртышынын клеткаларынын жана AJs деламинациясына алып келет.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre (A') менен белгиленген мигрант баш мээнин нерв кыртыш клеткаларын (CNCC) алып жүрүүчү эмбрион.Ал эми Specc11 мутант эмбриондору ачык нейрон бүктөмдөрүн (B), жебе учтары) жана көчүп кетпеген CNCCлерди (B', жебе учтары) көрсөтөт.(C, D') E10.5 WT эмбриондорунун (C, C') жана Specc1l (D, D') CNCC маркер DLX2 жаркыраган талаа сүрөттөрү (C, D') жана иммуноскоп (C', D').WT E10.5 эмбриондорунда DLX2-оң CNCC гилл аркаларын колонизациялайт (C', жебелер), ал эми мутанттарда ачык нерв бүктөмдөрүндө (D', жебелер) жана биринчи фарингалдык аркаларда (D', жебелер).) кээ бир боёктор (жебелер) менен CNCC начар катмарлануусун жана миграциясын көрсөтүп турат.ER) WT жана Specc1l мутант эмбриондорунун E8.5 (E–L) жана E9.5 (M–R) стадияларында бөлүмдөрү NCC маркерлери SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) жана DLX2 (I, J, Q, R).E8.5 боюнча NCC боёгу жапайы типтеги нейрон бүктөлүшү (NF) жана мутант бөлүмдөрүндө байкалган.E8.5 WT (K) жана мутант (L) менен SOX10 жана β-катенинди биргелешип боёгондо, нейрондук бүктөмөлөрдөгү клетканын чектеринде β-катениндин боёгу көбөйгөн.E9.5 боюнча, көчүп CNCCs (M, O, Q) жапайы типтеги боёо байкалган, ал эми мутанттар, unstratified CNCCs ачык нейрон бүктөмдөрүн (N, P, R) боёгон.(S–Z) E9.5 мутациясы бар WT жана Specc11DTM096/RRH048 эмбриондорунун короналдык бөлүмдөрүндө In vivo AJ этикеткалоо анализи.Болжолдуу секциялык тегиздик жогорку оң бурчта көрсөтүлгөн.Мутанттык ткандардын бөлүмдөрүндө F-актиндин (S, T) жана миозин IIb (U, V) боёгу күчөгөнү байкалган.3-сүрөттөгү in vitro натыйжаларына окшош, мутант эмбриондордо β-катенин (W, X) жана E-cadherin (Y, Z) үчүн жакшыртылган мембрана боёгу байкалган.(AA-BB) Апикалдык-базалдык клетканын чегинен тышкары караган жапайы типтеги эмбриондун бир бөлүгүнүн электрондук микросүрөтү жабышчаак кошулмаларды көрсөтүүчү так электрондуу аймакты көрсөтөт (AA, жебелер).Ал эми, Specc11 мутант эмбриондорунун бөлүмдөрүндө (BB, жебелер), бүт апикобазалдык түйүн электрондук тыгыз болуп, тыгыздыктын жогорулагандыгын жана жабышчаак түйүндөрдүн дисперсиясын көрсөтүп турат.
Кыскартылган катмарлануу өзгөргөн AJ менен шартталган деген гипотезабызды текшерүү үчүн биз Specc1l мутант эмбриондорунун ачык нейрон бүктөмдөрүндө AJ этикеткасын карадык (сүрөт 5S-Z).Биз актин стресс жипчелери (сүрөт. 5S, T) жана актин жипчелери боюнча миозин IIB боёп менен бирге көбөйгөн локалдаштыруу байкалган (сүрөт. 5U, V).Маанилүү нерсе, биз клеткалар аралык чектерде β-катениндин (сүрөт 5W, X) жана E-cadherinдин (сүрөт 5Y, Z) боёлушун байкадык.Биз ошондой эле E8.5 эмбриондорунун нейрон бүктөмөлөрүндө NCC β-катенин боёп карадык (сүрөт. 5K, L).β-катениндин боёлушу Specc1l мутанттык нейрондук бүктөмдөрүндө күчтүүрөөк болуп көрүндү (сүрөт 5L жана K), бул AJ өзгөрүүлөрүнүн башталгандыгын билдирет.E9.5 эмбриондорунун баш сөөгүнүн бөлүмдөрүнүн электрондук микросүрөттөрүндө биз WTге салыштырмалуу Specc1l мутант эмбриондорунда диффузиялык электрондук тыгыз боёктун көбөйгөнүн байкадык (сүрөт 5AA, BB жана S1E-H).Чогуу алганда, бул натыйжалар SPECC1L-kd U2OS клеткаларындагы биздин in vitro натыйжаларыбызды колдойт жана мутанттык эмбриондорубузда аберранттуу AJ боёосу CNCC стратификациясынан мурун болоорун сунуштайт.
AKT ишмердүүлүгү менен E-cadherin туруктуулугунун ортосундагы белгилүү антагонисттик байланышты эске алуу менен, 17,28 биз PI3K-AKT сигнализациясынын катышуусун гипотеза кылдык.Мындан тышкары, биз кээ бир мутант эмбриондорубузда E9.5-10.5 деңгээлинде өлүмгө учураган (<5%) жана анын ордуна E13.5 айланасында жайгашып калган субэпидермалдык ыйлаакчаларды байкадык (сүрөт S3).Subepidermal ыйлаакчалар PDGFRα12 негизинде кыскарган PI3K-AKT сигналынын өзгөчөлүгү болуп саналат.Fantauzzo жана башкалар.(2014) PdgfraPI3K/PI3K мутанттык эмбриондордо PDGFRα негизиндеги PI3K активдештирүүсүнүн үзгүлтүккө учурашы субэпидермалдык везикулаларга, нерв түтүкчөлөрүнүн кемчиликтерине жана таңдайдын жырык фенотиптерине алып келет деп билдирди.Чынында эле, pan-AKT жана активдүү phosphorylated Ser473-AKT денгээлдери E9.5 эмбриондук камакка алуу (сүрөт. 6A-D) Specc1l мутант ткандардын in vivo кыскарган.Фосфорланган Ser473-AKT деңгээлинин төмөндөшү толугу менен in vivo (6E-сүрөт) жана in vitro (6F-сүрөт) pan-AKT деңгээлинин төмөндөшүнө байланыштуу болушу мүмкүн.In vitro төмөндөшү U2OS клеткалары клетка формасынын жана AJ тыгыздыгынын өзгөрүшүнө катуу кошулганда гана байкалган (Figure 6D).Ошентип, биздин маалыматтар SPECC1L краниофациалдык морфогенездеги PI3K-AKT сигнализациясынын жаңы оң жөнгө салуучусу экенин көрсөтүп турат.
(A–E) E8.5 (A,B) жана E9.5 (C,D) баш сөөк бөлүктөрү же Specc1l мутант эмбриондорунун (E) E9.5 лизаттары активдүү phosphorylated S473-AKT жана pan-AKT протеинди кыскартуу деңгээлин көрсөткөн , башкаруу WT менен салыштырганда.Вестерн блоттинг жапайы типтеги лизаттарда жана мутанттык лизаттарда бирдей шарттарда аткарылган.SPECC1L үчүн көрсөтүлгөн сүрөттөр бир блоттон алынган.Ошол эле так алынып, анти-пан-ACT жана β-актин антителолору менен кайра текшерилди.E8.5 нейрон бүктөмдөрүндө Pan-AKT деңгээли (A, B) жана E9.5 баш сөөгүнүн бөлүмдөрүндө phosphorylated S473-AKT деңгээли бир кыйла төмөндөдү.(F) Pan-AKT деңгээли жогору кошулган жерде жыйналган SPECC1L-kd U2OS клеткаларынын лизаттарында ушундай эле кыскарган.Ката тилкелери үч көз карандысыз Western blot санынан алынган SEMдерди билдирет.(GJ) WT эмбриондорунун бөлүмдөрү E9.5 KI67 менен боёлгон жана тиешелүүлүгүнө жараша каспаза 3, клетканын көбөйүшүн (G, G') жана аз апоптоздук активдүүлүктү (H, H') көрсөтөт.Specc11 мутант эмбриондору салыштырмалуу клетка пролиферациясын (I) көрсөтөт, бирок апоптоздон өткөн клеткалардын саны кыйла көбөйөт (J).
Андан кийин биз пролиферация жана апоптоздун маркерлерин изилдедик.Биз E9.5 эмбриондорунун пролиферациясында эч кандай айырманы байкаган жокпуз (сүрөт 6E, I менен салыштырганда G) пролиферация индекси WT мутанттары үчүн 82,5% жана KI67 боёосу менен өлчөнгөн Specc1l мутанттары үчүн 86,5% (p <0,56, Фишердин көрсөткүчү). так тест).Ошо сыяктуу эле, биз эмбрион камакка чейин (көрсөтүлгөн эмес) (көрсөтүлгөн эмес) чейин E8.5 боюнча нейрон бүктөмөлөр менен cleaved caspase 3 үчүн боёо менен өлчөнгөн апоптоз эч кандай айырманы байкаган жок.Ал эми, апоптоз бардык E9.5 мутант эмбриондордо (сүрөт. 6F, H жана J) кыйла көбөйгөн.Апоптоздун бул жалпы өсүшү PI3K-AKT сигнализациясынын төмөндөшүнө жана эмбриондун алгачкы өлүмүнө29,30,31 туура келет.
Андан кийин, биздин kd клеткаларыбыздагы AJ өзгөрүүлөрүндө PI3K-AKT сигналынын себепчи ролун ырастоо үчүн, биз башкаруу жана kd клеткаларындагы жолду химиялык түрдө өзгөрттүк (Figure 7A-F).Биз маркер катары кошулган SPECC1L-kd клеткаларында байкалган клетка формасынын өзгөрүү фенотипин колдондук, аны биз эң узун өлчөмдүн (узундуктун) тиешелүү вертикалдык өлчөмгө (туура) катышын колдонуп сандык аныктадык.Салыштырмалуу тегерек же куб клеткалар үчүн 1 катышы күтүлүүдө (Figure 7G).Клетканын формасынан тышкары, биз β-катенин менен боёо менен AJга таасирин тастыктадык (сүрөт 7A'-F').Вортманнинди колдонуу менен PI3K-AKT жолун бөгөт коюу контролдук клеткалардагы клетканын формасын өзгөртүү үчүн жетиштүү болгон (Figure 7A, C) жана AJ (Figure 7A').PI3K-AKT активатору SC-79 башкаруу клеткаларындагы клетканын формасына (7А, Е) же AJ кеңейүүсүнө (7А'-сүрөт) таасирин тийгизген жок.SPECC1L-kd клеткаларында, PI3K-AKT жолунун андан ары басылышы апоптоздун көбөйүшүнө алып келди (сүрөт. 7B, D) жана биздин in vivo оор мутанттарыбызга ылайыктуу, β-катениндин боёосунда (сүрөт 7B') байкаларлык.Маанилүү нерсе, PI3K-AKT жолун активдештирүү клетканын формасын (Figure 7B,F) жана AJ фенотиптерин (Figure 7B") жакшыртты.Клетканын формасындагы өзгөрүүлөр клетканын тегеректигинин катышы (CCR) катары сандык бааланган жана жогоруда сүрөттөлгөндөй мааниге ээ болуу үчүн салыштырылган (FIG. 7G).Чынында эле, башкаруу клеткаларында (сүрөт. 7G, CCR = 1.56), wortmannin дарылоо байкалган окшош даражада клетканын формасын (сүр. 7G, CCR = 3.61, б <2.4 × 10-9) олуттуу өзгөртүү үчүн жетиштүү болгон. SPECC1Lде.-kd клеткалары (сүрөт 7G, CCR = 3.46).SPECC1L-kd клеткаларын Wortmannin менен дарылоо (сүрөт. 7G, CCR = 3.60, анча маанилүү эмес) тазаланбаган кд клеткаларынан (сүрөт. 7G, CCR = 3.46, анчалык деле маанилүү эмес) же wortmannin менен иштетилген башкаруу клеткаларынан (сүрөт. 7G) маанилүү болгон., CCR = 3.46, анча маанилүү эмес) кошумча клетканын узартылышына таасир этет (7G, CCR = 3.61, анча маанилүү).Баарынан маанилүүсү, SC-79 AKT активатору SPECC1L-kd клеткаларынын узун фенотибин калыбына келтирди (сүрөт. 7G, CCR = 1.74, б <6.2 × 10-12).Бул жыйынтыктар SPECC1L PI3K-AKT сигнализациясын жөнгө салгандыгын тастыктайт жана SPECC1Lдин орточо азайышы клетканын адгезиясына таасир этет, ал эми күчтүү төмөндөшү апоптозго алып келет (сүрөт 8).
(A–F') башкаруу (A, C, E) жана SPECC1L-kd (B, D, F) клеткалары PI3K-AKT жолунун ингибитору вортманнин (C, D) же SC-79 активатору (E, F) менен дарыланган .Тазаланбаган башкаруу клеткалары нормалдуу β-мышык уюлдук боёгу (A') менен куб сымал (A'), ал эми kd клеткалары узартылган (B) β-мышык боёосу (B').PI3K-AKT жолу басылгандан кийин, башкаруу клеткалары (C) β-мышык кеңейиши (C') менен узартылды, ал эми kd клеткалары биздин жогорку мутацияланган эмбриондорубузга окшош жана өтө өркүндөтүлгөн β-мышыкты көрсөткөн апоптозго (D) дуушарлана баштады.боёо (D').PI3K-AKT жолун активдештиргенден кийин, контролдоочу клеткалар куб (E) бойдон калып, нормалдуу β-мышык (E') боёосу бар, ал эми kd клеткалары клетканын формасын (F) жана β-кошикти (F') жакшыртты, бул (G) (AF) клетка формасынын өзгөрүү даражасы MetaMorph программалык камсыздоону колдонуу менен эң узун өлчөмдүн (узундугу) жана тиешелүү вертикалдык өлчөмдүн (туурасынын) клетканын тегеректигинин (CCR) жардамы менен сандык бааланган.Тазаланбаган (NT) SPECC1L-kd клеткалары (CCR = 3.46) контролдук клеткаларга караганда кыйла узун болгон (CCR = 1.56, б <6.1 × 10-13).Контролдук клеткалардагы PI3K-AKT жолунун Wortтун бөгөт коюусу клетка формасында окшош узартууну пайда кылуу үчүн жетиштүү болгон (CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9).Ошо сыяктуу эле, SPECC1L-kd клеткаларында SC-79 тарабынан AKT активдештирүү контролдук деңгээлдерине чейин клетканын узартылышын калыбына келтирди (CCR = 1.74, б <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd клеткаларынын Вортманнин менен дарылоосу апоптоздун көбөйүшүнө алып келди, бирок клетка формасынын өзгөрүшү (CCR = 3.60) .ns = маанилүү эмес.+/- 50 клетка үчүн SEM өлчөөлөрү көрсөтүлгөн.Статистикалык айырмачылыктар Студенттин t-тестинин жардамы менен эсептелген.
(A) PI3K-AKT жолунун бөгөт коюу жана активдештирүү схемалык өкүлчүлүгү, натыйжада AJ өзгөрүүлөр жана куткаруу, тиешелүүлүгүнө жараша.(B) SPECC1L тарабынан AKT протеин турукташтыруу үчүн сунушталган модель.
Premigratory CNCCs AJ лизис алдынкы нерв бүктөлүшү нейроэпителиалдык клеткалардан бөлүп талап кылат1,15,32.AJ компоненттеринин көбөйүшү жана SPECC1L жетишсиз клеткаларда апикалдык-базалдык AJ асимметриялык бөлүштүрүүнүн жоголушу in vitro жана in vivo, SPECC1Lдин β-катенинге физикалык жакындыгы менен айкалышып, SPECC1L AJ жергиликтүү туруктуулугун туура сактоо үчүн иштешин сунуштайт. уюштуруу булчуңдары.актин цитоскелети.SPECC1L актин цитоскелети жана β-катин менен байланышы жана SPECC1L жок болгон конденсацияланган актин жиптеринин санынын көбөйүшү AJ тыгыздыгынын байкалган өсүшүнө шайкеш келет.Дагы бир мүмкүнчүлүк, SPECC1L жетишсиз клеткалардагы актин жипчелеринин көбөйүшү клетка аралык чыңалуунун өзгөрүшүнө алып келет.Уюлдук стресс AJ 33 динамикасына таасирин тийгизгендиктен, чыңалуунун өзгөрүшү көбүрөөк диффузиялык AJ 34 алып келиши мүмкүн.Ошентип, ар кандай өзгөртүүлөр CNCC катмарларына таасир этет.
Wnt1 нейрондук кыртыш клеткаларын пайда кылган алгачкы нейрон бүктөмдөрүндө туюнат.Ошентип, Wnt1-cre линиясын издөө NCC35ке чейинки жана миграциялык белгилерди да белгилейт.Бирок, Wnt1 ошондой эле эрте нейрондук бүктөмөлөрдөн алынган арка мээ кыртышынын клондорун белгилейт 35,36, бул ачык нейрон бүктөмдөрүндө Wnt1 маркерлери үчүн E9.5 мутанттарынын биздин боёгубуз CNCC эмес деп болжолдойт.NCC маркерлеринин AP2A жана SOX10 үчүн оң боёшубуз Specc11 мутанттык эмбриондорунун ачык нейрон бүктөмдөрүндө чындап эле CNCC бар экенин тастыктады.Кошумчалай кетсек, AP2A жана SOX10 эрте миграциялык NCC маркерлери болгондуктан, оң боёо бул клеткалар E9.5 тарабынан катмарланууга мүмкүн эмес пост-миграциялык CNCC экенин көрсөттү.
Биздин маалыматтар AJдин SPECC1L тарабынан молекулярдык жөнгө салынышы PI3K-AKT сигналы аркылуу ишке ашат деп болжолдойт.SPECC1L жетишсиз клеткаларда жана ткандарда AKT сигнализациясы азаят.Fantauzzo et al.craniofasial morphogenesis PI3K-AKT сигнал үчүн түздөн-түз ролун колдоо.(2014) PDGFRα негизделген PI3K-AKT сигналдын жандануунун жоктугу жырык таңдай фенотипине алып келерин көрсөттү.Биз ошондой эле PI3K-AKT жолунун бөгөт коюу AJ жана U2OS клеткаларындагы клетка формасын өзгөртүү үчүн жетиштүү экенин көрсөтүп турат.Биздин тыянактарыбызга ылайык, Каин жана башкалар.37 эндотелийдик клеткалардагы PI3K α110 суббирдигинин төмөндөшү "байланыш индексинин" жогорулашы деп аталган периселлюлярдык β-катенин боёгунун окшош өсүшүнө алып келерин көрсөттү.Бирок, актин жиптери жогорку уюшкандыкта болгон эндотелий клеткаларында PI3K-AKT жолунун басылышы бош клетка формасына алып келет.Ал эми, SPECC1L-kd U2OS клеткалары узун клетка формасын көрсөттү.Бул айырма спецификалык клетканын түрү болушу мүмкүн.PI3K-AKT сигнализациясын басуу актин цитоскелетине биротоло таасир этсе, клетканын формасына таасири борбордук актин жипчелеринин тыгыздыгынын жана уюшулушундагы өзгөрүүлөрдөн келип чыккан чыңалуудагы өзгөрүүлөр менен аныкталат.U2OS клеткаларында SPECC1L жетишсиз AJ өзгөртүү жана калыбына келтирүү маркери катары клетканын формасынын өзгөрүүлөрүн гана колдондук.Жыйынтыктап айтканда, биз SPECC1L жетишсиздигинде AKT жолун бөгөт коюу AJ туруктуулугун жогорулатат жана CNCCде деламинацияны азайтат деп болжолдойбуз.
Кызыктуусу, pan-AKT деңгээли SPECC1L жок болгон учурда фосфорланган 473-AKT деңгээлдерине кошумча in vitro жана in vivo азайган, бул AKT протеининин туруктуулугунун же айлануусунун деңгээлинде PI3K-AKT сигнализациясын жөнгө салууну сунуштайт.SPECC1L жана MID1 гендер, эки Opitz / GBBB синдрому менен байланышкан, microtubules 18,22 турукташтыруу белокторду коддоо.SPECC1L жана MID1 микротүтүкчөлөрдү турукташтыруу механизми толук түшүнүлгөн эмес.SPECC1L учурда, бул турукташтыруу microtubules 18 бир чакан топтомун күчөтүлгөн acetylation камтыйт.Бул SPECC1L AKT сыяктуу башка белокторду турукташтыруу үчүн ушундай механизмди колдонушу мүмкүн.АКТ белогундагы лизин калдыктарынын ацетилдениши мембрананын локализациясынын жана фосфорлануунун төмөндөшүнө алып келери далилденген38.Мындан тышкары, AKT ошол эле лизин калдыгында K63 чынжырынын ubiquitination анын мембрана локалдаштыруу жана жандандыруу39,40 үчүн талап кылынат.Ар кандай жогорку өткөрүмдүүлүк ачыткы эки гибриддик экрандарда аныкталган SPECC1L протеиндери менен өз ара аракеттенген бир нече факторлордун ичинен төртөө - CCDC841, ECM2942, APC жана UBE2I43 - белоктун айлануусуна же ubiquitination же сумойлация аркылуу туруктуулугуна таасир эткен.SPECC1L AKT туруктуулугуна таасир этүүчү AKT лизин калдыктарынын пост-трансляциялык модификациясына тартылышы мүмкүн.Бирок AKT протеининин локализациясында жана туруктуулугунда SPECC1Lдин чечүүчү ролу ачыкталбай келет.
SPECC1L экспрессиясынын оор кемчиликтери in vivo AJ маркеринин боёшуна жана CNCC катмарынын бузулушуна, ошондой эле апоптоздун жана эрте эмбриондун өлүмүнө алып келди.Мурунку отчеттор апоптоздун деңгээли жогорулаган чычкан мутанттары нерв түтүкчөлөрүнүн 44,45,46,47 жана краниофациалдык дефекттери48 менен байланыштуу экенин көрсөткөн.Нейрондук бүктөлөрдө же фарингалдык аркаларда ашыкча клетка өлүмү туура морфогенетикалык кыймыл үчүн талап кылынган клеткалардын жетишсиздигине алып келиши мүмкүн 48,49,50.Ал эми, биздин SPECC1L жетишсиз клетка линиялары орточо кыскарган SPECC1L экспрессиясы менен клетка өлүмүнүн көбөйгөндүгүнүн далили жок гана AJ өзгөрүүлөрүн көрсөттү.Бирок, бул Kd клеткаларындагы PI3K-AKT жолунун химиялык бөгөт коюу апоптоздун көбөйүшүнө алып келди.Ошентип, SPECC1L экспрессиясынын же функциясынын орточо төмөндөшү клетканын жашоосун камсыздайт.Бул сейрек кездешүүчү Specc11 мутант эмбриондорунун ст.E9.5 - балким, генди кармоонун натыйжалуулугунун төмөндөшүнөн улам - алардын нерв түтүктөрүн жаап, кийинчерээк өнүгүүдө токтоп калышы мүмкүн, көбүнчө краниофациалдык кемчиликтер менен (сүрөт S3).Буга ошондой эле гетерозиготалуу Specc1l эмбриондорунун сейрек кездешүүчү краниофациалдык аномалиялары менен шайкеш келет - кыязы, генди кармоонун эффективдүүлүгүнүн жогорулашынан улам, ошондой эле зебрабалыктарда табылган эки SPECC1L ортологунун бири (specc1lb) кеч эмбриондук фенотиптердин жоголушуна алып келет. астыңкы жаак жана эки тараптуу жаракалар51.Ошентип, адам бейтаптарында аныкталган гетерозиготалуу SPECC1L функциясын жоготкон мутациялар краниофациалдык морфогенез учурунда SPECC1L функциясынын кичинекей бузулуштарына алып келиши мүмкүн, бул алардын орофациалдык жаракаларын түшүндүрүүгө жетиштүү.SPECC1L негизинде клетка аралык байланыштарды жөнгө салуу, ошондой эле палатогенезде жана фарингалдык аркалардын биригүүсүндө роль ойношу мүмкүн.SPECC1L функциясынын андан аркы изилдөөлөрү нейроэпителиалдык клетка кыймылында жана краниофациалдык морфогенезде нерв түтүгүн жабуу учурунда CNCCдеги убактылуу клетка аралык байланыштардын ролун аныктоого жардам берет.
U2OS остеосаркома башкаруу жана SPECC1L-kd клеткалары мурда сүрөттөлгөн (Saadi et al., 2011).SPECC1Lге каршы антителолор да мурда мүнөздөлгөн (Saadi et al., 2011).Анти-β-катенин антителолор (коён; 1: 1000; Санта-Круз, Даллас, TX) (чычкан; 1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), миозин IIb (1: 1000; Сигма-Олдрих, Сент-Луис ), MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан-Диего , Калифорния), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) жана β-актин (1: 2500; Сигма-Олдрих, Сент-Луис, MO ) сүрөттөлгөндөй колдонулган..Актин жиптери Acti-stain rhodaminphalloidin менен боёлгон (Цитоскелет, Денвер, Колорадо).
U2OS башкаруу клеткалары жана SPECC1L-kd клеткалары 10% түйүлдүктүн сывороткасы (Life Technologies, Карлсбад, CA) менен толукталган стандарттык жогорку глюкоза DMEMде өстүрүлгөн.AJ өзгөртүүлөр үчүн, 2 х 105 клеткалар 0,1% чочко желатин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO) менен мамиле айнек боюнча себилген жана клетка түрүндөгү өзгөрүүлөр үчүн байкалган.Клеткалар ар кандай көрсөтүлгөн убакыт чекиттеринде чогултулган: үрөндөн кийин 4 саат (t = 1), себилгенден кийин 24 саат (t = 2), клетканын формасы өзгөрбөстөн кошулуу (t = 3), клетканын формасынын өзгөрүшү (t = 4) , Клетка формасы өзгөргөндөн 24 сааттан кийин (t = 5) жана клетка формасы өзгөргөндөн кийин 48 сааттан кийин (t = 6) (сүрөт. 1, 2, 3).PI3K-AKT жолун модуляциялоо үчүн, клеткалар PI3K-AKT ингибитору вортманнин (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис, Миннесота) же SC-79 активатору (TOCRIS Biosciences, Миннеаполис Адамс, Миннесота) менен көрсөтүлгөн концентрацияларда өстүрүлдү.Химиялык заттарды камтыган чөйрө күн сайын алмаштырылып турат.
Кадр-кадр жазуулары кадимки маданият шарттарында жандуу контролдоо жана KD клеткаларында жасалган жана фазалык контраст сүрөттөрү 7 күн бою ар бир 10 мүнөт сайын чогултулган.Сүрөттөр QImaging Retiga-SRV камерасына туташтырылган механикалык стадия жана 10 × N-PLAN объектиси менен жабдылган компьютер менен башкарылган Leica DM IRB инверттүү микроскоптун жардамы менен алынган.Сүрөткө тартуу учурунда клетка маданияттары 5% СО2 менен нымдуу атмосферада 37°Cде сакталган.
Регионалдык мутант чычкан ресурстук борборунан (UC Davis, CA) эки ген тузак ES клетка линиялары DTM096 жана RRH048 Specc1111 жетишсиз чычкан линияларын түзүү үчүн колдонулган, Specc1lgtDTM096 жана Specc1lgtRRH046.Кыскача айтканда, 129/REJ ES клеткалары C57BL6 бластоцисттерине сайылган.Натыйжадагы химерикалык эркек чычкандар агути пальто түсү бар тукумдарды аныктоо үчүн ургаачы C57BL6 чычкандары менен өстүрүлдү.Гетерозиготаларды идентификациялоо үчүн ген капкан векторлорунун болушу колдонулган.Чычкандар 129/REJ;C57BL6 аралаш фонунда сакталган.Генетикалык тузак векторунун киргизүү сайтынын жайгашкан жери RT-PCR, геномдун секвенциясы жана генетикалык толуктоо менен тастыкталган (Кошумча 1-сүрөт).Кош гетерозиготалуу Specc1lGT чычкандарынын CNCC тукумуна байкоо жүргүзүү үчүн, ROSAmTmG (#007576) жана Wnt1-Cre (#003829) чычкандары (Джексон лабораториясы, Бар Харбор, ME) ROSAmTmG жана Wnt1-Cre аллелентин Specbryo-да өндүрүү үчүн кесилишкен.Чычкандарга жасалган бардык эксперименттер Канзас медициналык борборунун университетинин жаныбарларды багуу жана пайдалануу комитети тарабынан бекитилген протоколдорго ылайык жүргүзүлдү.
Эмбриондор (1% формальдегид, 0,2% глутаральдегид, 2 мм MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мм EGTA) бөлмө температурасында 60 мүнөткө бекитилди.X-gal боёо эритмесинде фиксациялангандан кийин (5 мМ калий феррицианид, 5 мм калий ферроцианид, 2 мМ MgCl2, 0,01% натрий дезоксихолат, 0,02% NP-40, 1 мг/мл X-гал) Боёкту иштеп чыгуу 37°Cде аткарылды. .°C 1-6 сааттын ичинде.Эмбриондор 4% PFAга орнотулган жана визуализацияланган.
Western blotting үчүн клеткалар пассивдүү лизис буферинде (Promega, Fitchburg, WI) HALT протеаза ингибиторлорунун (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, MO) аралашмасы менен толукталган.Лизаттар 12% полиакриламиддүү Mini-PROTEAN TGX даяр гелдерде (Bio-Rad, Hercules, CA) иштетилип, Immobilon PVDF мембраналарына (EMD Millipore, Billerica, MA) өткөрүлүп берилди.мембраналар 0,1% Tween камтыган PBS 5% сүт менен бөгөттөлгөн.Антителолор түнү бою 4°C температурада же бир саат бою бөлмө температурасында инкубацияланган.Femto SuperSignal West ECL реагент (Thermo Scientific, Waltham, MA) сигналды түзүү үчүн колдонулган.Иммундук боёк үчүн эмбриондор түнү бою 4% PFA/PBS ичинде бекитилип, криоконсервацияланган.Ткандардын криосекциялары 1% нормалдуу эчкинин сывороткасы (Thermo Scientific, Waltham, MA) жана 0,1% Triton X-100 (Сигма-Олдрих, Сент-Луис, МО) камтыган PBSте бөгөттөлгөн жана андан кийин инкубатордо 4°C температурада инкубацияланган. түн.анти-антитело жана флуоресценттик экинчи антитело (1:1000) менен 4°С 1 саат бою.Боялган бөлүктөр ProLong алтын чөйрөсүнө (Thermo Scientific, Waltham MA) жайгаштырылып, Leica TCS SPE конфокалдык микроскоптун жардамы менен жалпак сүрөттөр алынган.Ар бир иммуноскопия кеминде эки мутант эмбриондун цироссекцияларында үч көз карандысыз эксперимент катары аткарылган.Өкүл тажрыйба көрсөтүп турат.
Клеткалар модификацияланган RIPA буферинде инкубацияланган (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% глицерин, 2 мм EDTA жана HALT протеаза ингибитору (Sigma-Oldrich, St. LouisMO) Кыскача айтканда, лизаттар протеин G магниттик мончоктору (Life Technologies, Карлсбад, CA) менен алдын ала тазаланган жана андан кийин түнү бою 4° C температурада инкубацияланган. SPECC1L же IgG протеинине каршы G протеин мончоктору менен SPECC1L экстракциясы колдонулган жана Western blotting анти менен аткарылган. Жогоруда сүрөттөлгөн -β-катенин антителолору көрсөтүлгөн ко-IP эксперименттери төрт көз карандысыз эксперименттин өкүлү.
Туруктуу өстүрүлгөн клеткалар же чычкан эмбриондук ткандары Канзас университетинин медициналык борборунун электрондук микроскопиялык борборуна берилди.Кыскача айтканда, үлгүлөр EMbed 812 чайырына (Электрондук микроскопия илимдери, Форт Вашингтон, PA) салынып, 60°Cде түнү полимерленген жана алмаз бычак менен жабдылган Leica UC7 ультрамикротомунун жардамы менен 80 нмде кесилген.Бөлүмдөр 100 кВ Lab6 тапанчасы менен жабдылган JEOL JEM-1400 трансмиссиялык электрондук микроскоптун жардамы менен көрүлгөн.
Бул макаланы кантип келтирсе болот: Wilson, NR et al.SPECC1L жетишсиздиги бириктирилген муундардын туруктуулугун жогорулатат жана баш мээнин нерв клеткаларынын деламинациясын азайтат.илим.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Сен-Жанн, Ж.-П.Нерв кыртышынын индукциясы жана дифференциациясы.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Кордеро, ДР жана башкалар.Кыймылдагы баш мээнин нерв клеткалары: алардын craniofacial өнүгүүсүндөгү ролу.Америкалык медициналык генетика журналы.Part A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, RP Neurocristopathia: 20 жыл ичинде анын өсүшү жана өнүгүшү.Педиатр.патология.лаборатория.дары.17, 1–25 (1997).
Манголд Э., Людвиг К.У жана Нотен М.М.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. жана Райли, FM Крандык нерв кыртышынын клетка миграциясынын молекулярдык механизмдери жана craniofacial өнүктүрүү учурунда үлгү.Иштеп чыгуу 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Диксон, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH жана Murray, JK Cleft эрин жана таңдай: генетикалык жана экологиялык таасирлерди түшүнүү.табигый комментарий.Генетика 12, 167–178, дой: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Интерферонду жөнгө салуучу фактор-6 (Irf6) жетишсиз чычкандарда теринин, буту-колунун жана баш-бетинин анормалдуу морфогенези.National Genette.38, 1335–1340, дой: 10.1038/ng1903 (2006).
Пейрард-Джанвид, М.GRHL3 басымдуу мутациялары ван дер Ваорд синдромун пайда кылып, ооздун перидермасынын өнүгүшүн начарлатат.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ жана Juriloff, DM Нейрондук түтүктү жабууда кемчиликтери бар чычкан мутанттарынын тизмесин жаңыртуу жана нерв түтүгүнүн жабылышын толук генетикалык түшүнүүгө карай прогресс.Тубаса кемтиктерди изилдөө.Бөлүм А, Клиникалык жана Молекулярдык Тератология 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K ортомчу PDGFRalpha сигналдык p53 көз каранды клетка ичиндеги жол аркылуу скелет өнүгүүсүндө жашоону жана жайылышын жөнгө салат.Ген өнүктүрүү 28, 1005–1017, дой: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Копп, AJ, Грин, НД жана Мердок, Дж.Н. Дишевелед: Конвергенттик кеңейүүнүн нервдик түтүктү жабууга болгон байланышы.Неврологиядагы тенденциялар.26, 453–455, дой: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).